• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    多花黃精多糖對(duì)斑馬魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型的藥效學(xué)研究

    2021-11-08 07:38:24曹語珈王子麗邊金煥安禮友許舒雯龔祝南
    中草藥 2021年21期
    關(guān)鍵詞:糖尿病模型

    曹語珈,王 凱,王子麗,邊金煥,安禮友,許舒雯,龔祝南, *

    多花黃精多糖對(duì)斑馬魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型的藥效學(xué)研究

    曹語珈1,王 凱2#,王子麗1,邊金煥3,安禮友3,許舒雯2*,龔祝南1, 3*

    1. 南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210046 2. 安徽省科學(xué)技術(shù)研究院,安徽 合肥 230031 3. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210046

    研究多花黃精多糖對(duì)斑馬魚幼魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的作用。用鏈脲佐菌素和潑尼松龍建立斑馬魚幼魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型,設(shè)置對(duì)照組、模型組、二甲雙胍+依替膦酸二鈉組和多花黃精多糖(60、120、240 μg/mL)組,考察藥物對(duì)斑馬魚早期發(fā)育毒性的影響;采用試劑盒測(cè)定各組幼魚組織的糖含量;采用茜素紅染色法考察各組斑馬魚頭骨礦化面積和骨密度;采用qRT-PCR法檢測(cè)各組斑馬魚骨質(zhì)疏松相關(guān)基因Runx家族轉(zhuǎn)錄因子2b(Runx family transcription factor 2b,)、Sp7轉(zhuǎn)錄因子(Sp7 transcription factor,)、I型膠原蛋白α2(collagen type I α2,)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白質(zhì)因子(cysteine-rich acidic secreted protein,)和維生素D受體b(vitamin D receptor b,)mRNA表達(dá)情況。顯微注射鏈脲佐菌素和浸泡潑尼松龍能夠提高幼魚組織糖濃度,降低頭骨礦化面積和骨密度。與模型組比較,多花黃精多糖顯著上調(diào)斑馬魚幼魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型、、、、mRNA表達(dá)水平(<0.05、0.01、0.001)。多花黃精多糖對(duì)斑馬魚幼魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型有較好的降血糖及抗骨質(zhì)疏松癥作用。

    斑馬魚;多花黃精;多糖;糖尿?。还琴|(zhì)疏松

    糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝紊亂性疾病[1],高血糖可增加晚期糖基化終端產(chǎn)物的蓄積,抑制成骨細(xì)胞的形成,激活破骨細(xì)胞,成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡被打破,影響骨的正常形成,從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生,因此2型糖尿病患者很容易產(chǎn)生骨質(zhì)疏松這一并發(fā)癥[2-3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用降糖、促進(jìn)骨生成、抗氧化等常規(guī)治療,均存在不足與局限,而中藥治療具有顯著的潛力和優(yōu)勢(shì),正逐漸被接受和使用。黃精系藥食同源的多年生草本植物,具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎之效[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黃精的主要成分黃精多糖具有降血糖、調(diào)血脂、抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫等作用[5]。多花黃精Hua屬天門冬科黃精屬植物,與滇黃精、黃精一同收錄于《中國藥典》2020年版[6]。目前,多花黃精多糖的降血糖合并骨質(zhì)疏松癥研究鮮有報(bào)道。

    本研究通過分析多花黃精多糖對(duì)2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚幼魚模型的組織糖含量、骨骼礦化面積、積累光密度[7]和骨代謝相關(guān)因子表達(dá)等影響,來評(píng)價(jià)多花黃精多糖對(duì)糖尿病合并骨質(zhì)疏松的作用,以期為后續(xù)研究提供參考。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物

    AB系野生型斑馬魚購自上海費(fèi)曦生物科技有限公司。

    1.2 藥材

    黃精于2016年7月采自安徽省青陽縣九華山地區(qū),經(jīng)南京師范大學(xué)生命科學(xué)院龔祝南教授鑒定為天門冬科植物多花黃精Hua的根莖。

    1.3 藥品與試劑

    多花黃精多糖(批號(hào)20191113)由安徽省科學(xué)技術(shù)研究院提供;Runx家族轉(zhuǎn)錄因子2b(Runx family transcription factor 2b,)、Sp7轉(zhuǎn)錄因子(Sp7 transcription factor,)、I型膠原蛋白α2(collagen type I α2,)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白質(zhì)因子(cysteine-rich acidic secreted protein,)、維生素D受體b(vitamin D receptor b,)、引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;鏈脲佐菌素(批號(hào)20191022)購自廣州賽國生物科技有限公司;潑尼松龍(批號(hào)c10788051)、鹽酸二甲雙胍(批號(hào)c10440628)購自上海麥克林生化科技有限公司;依替膦酸二鈉(批號(hào)20191015)購自中國藥品生物制品檢定所;茜素紅S(批號(hào)20191203)、檸檬酸(批號(hào)20190409)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸鈉(批號(hào)190311-1)購自西隴科學(xué)股份有限公司;QuantiChrom? Glucose Assay Kit葡萄糖測(cè)試盒購自北京群曉科苑生物技術(shù)有限公司。

    1.4 儀器

    恒溫光照培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司);IM-9B型手動(dòng)斑馬魚顯微注射泵(日本Narishige公司);qRT-PCR儀(瑞士Roche公司);EVOS新型顯微鏡細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國Life Technologies公司)。

    2 方法

    2.1 多花黃精多糖的制備

    多花黃精經(jīng)洗凈烘干,切片,粉粹成60目,備用。取0.5 kg多花黃精粉末加入5倍量水,85 ℃水浴回流提取2次,2 h/次,濾過,取濾液,恒溫水浴濃縮至一定體積,濾過除渣。所得濾液加3倍量100%乙醇,于4 ℃放置24 h,抽濾后減壓干燥得沉淀,冷凍干燥所得粉末即為黃精粗多糖。由安徽省科學(xué)技術(shù)研究院提取并檢測(cè),采用苯酚硫酸法測(cè)定多花黃精粗多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63.7%[8]。

    2.2 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液及藥液的制備

    2.2.1 10×E3斑馬魚胚胎培養(yǎng)液的制備 稱取NaCl 1 462.5 mg、KCl 63.325 mg、CaCl2242.583 mg、MgSO4198 mg,加入適量單蒸水溶解,超聲20 min,待全部溶解后移入500 mL量瓶中,定容,于4 ℃保存?zhèn)溆?,后續(xù)用單蒸水稀釋10倍使用。

    2.2.2 500 μg/mL鏈脲佐菌素母液的制備 稱取0.015 g鏈脲佐菌素粉末,加入適量純凈水溶解,超聲5 min,保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.3 1 mg/mL鹽酸二甲雙胍母液的制備 稱取0.025 g鹽酸二甲雙胍粉末,加入適量純凈水溶解,超聲5 min,保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.4 120 μg/mL潑尼松龍母液的制備 稱取2.6 mg潑尼松龍粉末,滴加微量二甲基亞砜(DMSO)使其溶解后,再加入適量純凈水,磁力攪拌器攪拌3 min,保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.5 180 μg/mL依替膦酸二鈉母液的制備 稱取6.3 mg依替膦酸二鈉固體,加入適量純凈水溶解,超聲5 min,保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.6 480 μg/mL多花黃精多糖母液的制備 稱取16.8 mg多花黃精多糖粉末,加入適量純凈水溶解,超聲10 min,保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3 藥物對(duì)斑馬魚早期發(fā)育毒性的影響

    挑選受精后第2天(2 dpf)的斑馬魚胚胎,置24孔板,每孔6個(gè)胚胎,設(shè)置對(duì)照組、鏈脲佐菌素(50、100、200、300、400、500 μg/mL)、潑尼松龍(5、10、20、40、80、120 μg/mL)、二甲雙胍(50、100、200、400、800、1000 μg/mL)、依替膦酸二鈉(30、60、90、120、150、180 μg/mL)和多花黃精多糖(80、160、240、320、400、480 μg/mL)組,設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換1次液,給藥周期為8 d,每8小時(shí)觀察幼魚的狀態(tài),發(fā)現(xiàn)死亡的魚卵或幼魚及時(shí)挑出,4 dpf通過EVOS新型顯微鏡細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察斑馬魚給藥后的形態(tài)變化,計(jì)算胚胎孵化率和死亡率,繪制最佳“死亡率-濃度”效應(yīng)曲線,用GraphPad Prisr 6.0軟件擬合得出半數(shù)致死濃度(half lethal concentration,LC50)值[9]。

    胚胎孵化率=孵化的胚胎數(shù)量/總胚胎數(shù)量

    胚胎死亡率=死亡胚胎數(shù)量/總胚胎數(shù)量

    2.4 斑馬魚幼魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型的建立和給藥

    選擇2 dpf的斑馬魚胚胎放置在瓊脂糖魚卵固定板上,采用顯微注射方式在卵黃囊部位注射2 nL鏈脲佐菌素(200 μg/mL),注射完成的胚胎立即放回E3培養(yǎng)液,以免停留時(shí)間過久導(dǎo)致胚胎死亡,影響死亡率。注射后每8小時(shí)觀察,移除脫下的卵黃膜,4 dpf后轉(zhuǎn)移到24孔板中(6尾/孔)并采用直接浸泡潑尼松龍(10 μg/mL)方式造模。置24孔板,6尾/孔,設(shè)置對(duì)照組、模型組、二甲雙胍(150 μg/mL)+依替膦酸二鈉(30 μg/mL)組和多花黃精多糖(60、120、240 μg/mL)組,每組90~100尾。培養(yǎng)周期為4 d,隔2 d換新液體,直至8 dpf。

    2.5 幼魚組織的糖含量測(cè)定

    由于無法在幼魚身上獲得血液樣本,因此測(cè)定整個(gè)魚體勻漿中的糖含量。給藥后4 dpf和8 dpf的斑馬魚幼魚每組各取30尾,加入200 μL冰PBS溶液充分研磨,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,采用QuantiChrom? Glucose Assay Kit葡萄糖測(cè)試盒進(jìn)行測(cè)定。

    2.6 斑馬魚礦化骨骼定量分析

    取培養(yǎng)至8 dpf的斑馬魚幼魚置于培養(yǎng)皿中,加入4%多聚甲醛,4 ℃固定過夜;用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3遍,用0.5% KOH和3% H2O2的漂白劑脫色30 min至斑馬魚無黑色素,去除漂白劑后,加入4%多聚甲醛,4 ℃固定過夜;PBST清洗3次,甲醇梯度洗脫,置換20% DMSO-80%甲醇,于?20 ℃保存;4 h后復(fù)水和染色,用PBST洗3遍,于0.5% KOH配制的茜素紅染液中染色過夜,室溫避光孵育12 h以上,去除染色液,用PBST洗3遍,再更換為80%甘油,避光保存,于顯微鏡下拍照,采用Image pro plus 6.0軟件分析頭部骨骼染色面積和骨密度。

    2.7 qRT-PCR檢測(cè)骨質(zhì)疏松相關(guān)基因mRNA表達(dá)

    從對(duì)照組、模型組、二甲雙胍+依替膦酸二鈉組和多花黃精多糖(60、120、240 μg/mL)組選取25尾8 dpf斑馬魚幼魚,按照試劑盒說明書提取斑馬魚組織總RNA并合成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    表1 引物序列

    3 結(jié)果

    3.1 斑馬魚早期發(fā)育死亡率和孵化率

    選取2 dpf斑馬魚胚胎給藥,培養(yǎng)7 d得出鏈脲佐菌素、潑尼松龍、二甲雙胍、依替膦酸二鈉和多花黃精多糖對(duì)斑馬魚幼魚的LC50(表2)。從圖1可以看出,480 μg/mL多花黃精多糖給藥后斑馬幼魚很快死亡,320 μg/mL多花黃精多糖給藥5 d后斑馬魚出現(xiàn)明顯死亡且死亡率較低,并且在6 dpf之后死亡率保持不變;斑馬魚孵化率在3~4 dpf時(shí)保持不變。

    表2 各藥物對(duì)斑馬魚幼魚的LC50值 (6 dpf)

    圖1 多花黃精多糖對(duì)斑馬魚死亡率和孵化率的影響

    3.2 多花黃精多糖對(duì)斑馬魚幼魚形態(tài)和心臟毒性的影響

    4 dpf斑馬魚魚卵已經(jīng)發(fā)育成熟,幼魚將從絨毛膜中孵化出,同時(shí)心臟已經(jīng)發(fā)育[10],因此選擇4 dpf時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行毒性暴露和心臟毒性分析。圖2清晰地展示了不同質(zhì)量濃度多花黃精多糖給藥后斑馬魚幼魚形態(tài)和心臟組織形態(tài)變化。發(fā)育異常的斑馬魚的腹部或腹部周圍會(huì)發(fā)生水腫或出血現(xiàn)象,造成身體畸形包括脊柱彎曲和折尾等,同時(shí)斑馬魚幼魚心臟組織形態(tài)發(fā)生異常,心包囊腫等癥狀逐漸加重。從圖中可以看出,與對(duì)照組比較,多花黃精多糖(160 μg/mL)組斑馬魚出現(xiàn)輕微腹部水腫和心臟毒性,400 μg/mL多花黃精多糖組斑馬魚水腫和心包囊腫明顯,呈劑量相關(guān)性。結(jié)合LC50值,后續(xù)實(shí)驗(yàn)多花黃精多糖給藥質(zhì)量濃度為60~240 μg/mL,避免影響斑馬魚幼魚發(fā)育異常和死亡。

    圖2 多花黃精多糖對(duì)斑馬魚幼魚形態(tài)和心臟毒性的影響(×10)

    3.3 多花黃精多糖對(duì)幼魚組織糖含量的影響

    使用QuantiChrom? Glucose Assay Kit葡萄糖測(cè)試盒檢測(cè)組織糖含量。在0~300 mg/dL內(nèi),斑馬魚幼魚組織糖含量與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:=0.000 9+0.001,=0.999 9;其中,是葡萄糖測(cè)試盒中對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度,是吸光度。

    當(dāng)模型組斑馬魚的血糖水平高于對(duì)照組3倍時(shí),可認(rèn)為糖尿病斑馬魚造模成功[11-12]。如圖3所示,2 dpf斑馬魚胚胎注射鏈脲佐菌素后,4 dpf模型組斑馬魚幼魚的組織糖含量為3.457 nmol/尾,明顯高于對(duì)照組的1.063 nmol/尾,為對(duì)照組的3.25倍。潑尼松龍浸泡給藥后8 dpf模型組糖含量為3.068 nmol/尾,為對(duì)照組的2.88倍,表明給予潑尼松龍后,斑馬魚幼魚達(dá)到2型糖尿病的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),因此斑馬魚幼魚2型糖尿病模型構(gòu)建成功。

    圖3 多花黃精多糖對(duì)幼魚組織糖含量的影響(, n = 3)

    與模型組比較,二甲雙胍+依替膦酸二鈉組和多花黃精多糖(60、120、240 μg/mL)組斑馬魚組織糖含量有降低的趨勢(shì),且呈劑量相關(guān)性。由于高劑量多花黃精多糖對(duì)幼魚會(huì)有形態(tài)和心臟毒性,未能進(jìn)一步加大給藥濃度充分驗(yàn)證其降糖作用。

    3.4 斑馬魚礦化骨骼定量分析

    各組8 dpf斑馬魚腹面頭骨茜素紅染色的顯微成像見圖4,斑馬魚頭骨礦化面積和骨密度見圖5。與對(duì)照組相比,模型組斑馬魚頭骨礦化面積和骨密度顯著降低(<0.01、0.001),表明鏈脲佐菌素+潑尼松龍成功誘導(dǎo)了糖尿病斑馬魚骨質(zhì)疏松模型。與模型組比較,多花黃精多糖組斑馬魚頭骨礦化面積和骨密度顯著升高(<0.05、0.01),且呈劑量相關(guān)性。

    3.5 qRT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞基因mRNA表達(dá)

    如圖6所示,與對(duì)照組比較,模型組斑馬魚、、、、mRNA表達(dá)水平均顯著降低(<0.05、0.001);與模型組比較,多花黃精多糖組、、、、mRNA表達(dá)水平均顯著升高(<0.05、0.01、0.001),且呈劑量相關(guān)性。

    4 討論

    2型糖尿病患者的血糖比正常人偏高[13],一方面由于外周血管粥樣硬化使血供明顯減少,易出現(xiàn)肢體壞疽,運(yùn)動(dòng)負(fù)荷減小,嚴(yán)重影響骨質(zhì)量;另一方面糖尿病微血管病變[14],造成骨組織的血液不能正常供應(yīng),血液內(nèi)營(yíng)養(yǎng)障礙,影響骨質(zhì)量和骨密度,這些都會(huì)使骨質(zhì)疏松發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)隨之增加。降糖藥物主要影響2型糖尿病患者血糖水平,但對(duì)機(jī)體除血糖外的其他指標(biāo)也有一定影響。自從研究人員發(fā)現(xiàn)噻唑烷二酮類降糖藥物[15]有增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)后,就廣泛開展了大量關(guān)于降糖藥物和骨代謝及骨密度的臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。多項(xiàng)研究顯示,各類降糖藥物在穩(wěn)定血糖的同時(shí)也對(duì)骨代謝造成影響,因此預(yù)防糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展,改善骨代謝對(duì)患者有重要作用[16]。

    圖4 骨骼染色的顯微成像 (×10)

    與對(duì)照組比較:#P<0.05 ##P<0.01 ###P<0.001;與模型組比較:*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001,圖6同

    圖6 多花黃精多糖對(duì)斑馬魚Runx2b、Sp7、vdrb、sparc、col1a2 mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

    本研究利用斑馬魚體型小、易飼養(yǎng)、繁殖周期短等其他模式生物不具備的優(yōu)點(diǎn)[17-18]建立2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚幼魚模型。通過加入不同濃度的藥物觀察并統(tǒng)計(jì)對(duì)斑馬魚生長(zhǎng)發(fā)育的影響,選擇給予鏈脲佐菌素(200 μg/mL)和潑尼松龍(10 μg/mL)進(jìn)行造模,通過試劑盒測(cè)定斑馬魚組織糖含量后,采用茜素紅對(duì)斑馬魚礦化骨骼進(jìn)行固定染色,分析骨礦化面積和骨密度。結(jié)果表明,給予鏈脲佐菌素和潑尼松龍后能夠建立2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚幼魚模型。

    黃精是中醫(yī)臨床常用的治療消渴癥較為有效的中藥。黃精多糖是黃精的主要有效成分,黃精可入腎經(jīng),中醫(yī)理論認(rèn)為腎主骨生髓,因此黃精多糖具有應(yīng)用于治療骨代謝相關(guān)疾病的潛在作用[19]。本研究利用2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚幼魚模型研究多花黃精多糖降血糖和抗骨質(zhì)疏松作用,通過qRT-PCR法檢測(cè)多花黃精多糖對(duì)2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚模型成骨細(xì)胞標(biāo)志基因、、、、mRNA表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,與模型組比較,多花黃精多糖可以通過上調(diào)和mRNA表達(dá),調(diào)控成骨細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)反應(yīng),共同加速成骨細(xì)胞分化;而vdrb這種維生素D受體轉(zhuǎn)錄因子,能調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣或磷酸鹽的吸收,多花黃精多糖能夠上調(diào)和mRNA表達(dá),有助于皮膚、骨骼、肌腱以及其他纖維連接組織。sparc不僅在骨骼組織中引起活躍的礦化作用,還能夠促進(jìn)與游離的鈣離子結(jié)合。因此,多花黃精多糖能夠不同程度地降低2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚組織糖濃度,上調(diào)成骨細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá),促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,恢復(fù)維持骨骼礦化,加快骨重建。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

    [1] 宋超, 劉祖德. 2型糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松的機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 中國骨質(zhì)疏松雜志, 2010, 16(2): 139-142.

    [2] Liu J M, Zhu D L, Mu Y M,. Management of fracture risk in patients with diabetes-Chinese expert consensus [J]., 2019, 11(11): 906-919.

    [3] Evely R S, Bonomo A, Schneider H G,. Structural requirements for the action of parathyroid hormone- related protein (PTHrP) on bone resorption by isolated osteoclasts [J]., 1991, 6(1): 85-93.

    [4] 陳曄, 孫曉生. 黃精的藥理研究進(jìn)展 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2010, 21(3): 328-330.

    [5] 陸建平, 張靜, 張艷貞. 黃精多糖的功能活性及應(yīng)用前景 [J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2013, 4(1): 273-278.

    [6] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 319-320.

    [7] 陳穎. 抗骨接生軟膏藥學(xué)研究及斑馬魚評(píng)價(jià) [D]. 南京: 南京中醫(yī)藥大學(xué), 2017.

    [8] 肖小妹, 沈小雄, 張桂生, 等. 黃精多糖對(duì)兒童腎病綜合征紅細(xì)胞免疫功能影響的研究 [J]. 贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2018, 38(2): 134-136.

    [9] 魯疆, 王占洋, 袁玉婷, 等. 氯化鎘對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性 [J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2013, 8(3): 381-388.

    [10] Kari G, Rodeck U, Dicker A P. Zebrafish: An emerging model system for human disease and drug discovery [J]., 2007, 82(1): 70-80.

    [11] 朱妍, 秦衛(wèi)松. 糖尿病斑馬魚模型研究進(jìn)展 [J]. 腎臟病與透析腎移植雜志, 2021, 30(1): 59-63.

    [12] 勞喬聰, 俞航萍, 李春?jiǎn)? 斑馬魚糖尿病模型評(píng)價(jià)常用降糖藥物降糖藥效[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2015(31): 248.

    [13] Alberti K G, Zimmet P Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: Diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation [J]., 1998, 15(7): 539-553.

    [14] Colman J R, Twiner M J, Hess P,. Teratogenic effects of azaspiracid-1 identified by microinjection of Japanese medaka () embryos [J]., 2005, 45(7): 881-890.

    [15] 馬長(zhǎng)宏, 張翼翔. 噻唑烷二酮類藥物治療2型糖尿病的效果 [J]. 中國實(shí)用醫(yī)藥, 2009, 4(19): 248-250.

    [16] 莊會(huì)艷. 噻唑烷二酮類藥物的藥理作用研究 [J]. 醫(yī)學(xué)食療與健康, 2019(17): 88.

    [17] Dooley K, Zon L I. Zebrafish: A model system for the study of human disease [J]., 2000, 10(3): 252-256.

    [18] 段秀英, 馬瑞嬌, 張?jiān)? 等.斑馬魚炎癥模型及其在中藥抗炎領(lǐng)域的應(yīng)用[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2021, 44(8): 1573-1580.

    [19] 姜程曦, 張鐵軍, 陳常青, 等. 黃精的研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)分析 [J]. 中草藥, 2017, 48(1): 1-16.

    Pharmacodynamics study of polysaccharide fromon zebrafish model with type 2 diabetic and osteoporosis

    CAO Yu-jia1, WANG Kai2, WANG Zi-li1, BIAN Jin-huan3, AN Li-you3, XU Shu-wen2, GONG Zhu-nan1,3

    1. School of Food and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China 2. Anhui Academy of Science and Technology, Hefei 230031, China 3. School of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China

    To study the effect of polysaccharide from(PSP) on type 2 diabetes and osteoporosis in juvenile zebrafish.A zebrafish juvenile type 2 diabetes model with osteoporosis was established with streptozotocin and prednisolone, which were divided into control group, model group, metformin + etidronate disodium group and PSP (60, 120, 240 μg/mL) groups, the effect of drugs on early developmental toxicity of zebrafish was investigated; Kit was used to determine the sugar content of juvenile fish tissues in each group; Alizarin red staining method was used to investigate the mineralized area and bone mineral density in bones of zebrafish in each group; qRT-PCR was used to detect osteoporosis-related genes Runx family transcription factor 2b (), Sp7 transcription factor (), type I collagen α2 (), cysteine-rich acidic secreted protein () and vitamin D receptor b () mRNA expressions in zebrafish.Microinjection of streptozotocin and immersion of prednisolone increased the sugar concentration of juvenile fish tissues, reduced the mineralized area and bone density of skull. Compared with model group, PSP significantly up-regulated mRNA expression levels of,,,andin zebrafish juvenile type 2 diabetes mellitus with osteoporosis model (< 0.05, 0.01, 0.001).PSP has a good hypoglycemic and anti-osteoporosis effect on zebrafish juvenile with type 2 diabetes and osteoporosis.

    zebrafish;Hua; polysaccharide; type 2 diabetes; osteoporosis

    R285.5

    A

    0253 - 2670(2021)21 - 6545 - 07

    10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.012

    2021-04-13

    安徽省博士后研究人員科研活動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(2020A396);安徽省2020年度中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)項(xiàng)目(202007d06020007)

    曹語珈(1997—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。Tel: 13814780060 E-mail: caoyujiaguodong@hotmail.com

    許舒雯,研究員。E-mail: shuwne_xu@163.com

    龔祝南,教授,碩士生導(dǎo)師。E-mail: gongzhunan@njnu.edu.cn

    #共同第一作者:王 凱(1987—),男,碩士,助理研究員,研究方向?yàn)閿?shù)據(jù)分析、科研管理。Tel: 17730201081 E-mail: woyun_2002@163.com

    [責(zé)任編輯 李亞楠]

    猜你喜歡
    糖尿病模型
    一半模型
    糖尿病知識(shí)問答
    中老年保健(2022年5期)2022-08-24 02:35:42
    糖尿病知識(shí)問答
    中老年保健(2022年1期)2022-08-17 06:14:56
    糖尿病知識(shí)問答
    中老年保健(2021年5期)2021-08-24 07:07:20
    糖尿病知識(shí)問答
    中老年保健(2021年9期)2021-08-24 03:51:04
    糖尿病知識(shí)問答
    中老年保健(2021年7期)2021-08-22 07:42:16
    糖尿病知識(shí)問答
    重要模型『一線三等角』
    重尾非線性自回歸模型自加權(quán)M-估計(jì)的漸近分布
    3D打印中的模型分割與打包
    亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲,欧美精品.| videos熟女内射| 国产真人三级小视频在线观看| 国产免费现黄频在线看| 亚洲国产av影院在线观看| 色视频在线一区二区三区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一个人免费看片子| 老司机影院毛片| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产亚洲一区二区精品| 99国产精品免费福利视频| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品成人av观看孕妇| avwww免费| 欧美xxⅹ黑人| 美女扒开内裤让男人捅视频| 老司机影院成人| av在线app专区| 亚洲国产日韩一区二区| 国产麻豆69| 日本av手机在线免费观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美日韩成人在线一区二区| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| av视频免费观看在线观看| 精品福利永久在线观看| 精品一区在线观看国产| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 人妻 亚洲 视频| 日本a在线网址| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜日韩欧美国产| 三上悠亚av全集在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 99香蕉大伊视频| 午夜免费鲁丝| 12—13女人毛片做爰片一| 在线精品无人区一区二区三| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久综合国产亚洲精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 午夜福利免费观看在线| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 在线观看舔阴道视频| 亚洲伊人色综图| 女人久久www免费人成看片| 免费在线观看黄色视频的| 精品第一国产精品| av在线播放精品| 制服人妻中文乱码| 久久午夜综合久久蜜桃| 真人做人爱边吃奶动态| 午夜91福利影院| 水蜜桃什么品种好| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 乱人伦中国视频| 国产主播在线观看一区二区| 十八禁网站免费在线| 天天添夜夜摸| 日韩大码丰满熟妇| bbb黄色大片| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲色图综合在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 搡老乐熟女国产| 91精品伊人久久大香线蕉| 高清欧美精品videossex| 亚洲欧美激情在线| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 午夜福利乱码中文字幕| 大香蕉久久网| 母亲3免费完整高清在线观看| 99热国产这里只有精品6| 欧美另类亚洲清纯唯美| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩 亚洲 欧美在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产真人三级小视频在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美日韩黄片免| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一区在线观看完整版| 免费一级毛片在线播放高清视频 | videosex国产| 精品久久蜜臀av无| 亚洲中文字幕日韩| 国产成人精品在线电影| 中文字幕色久视频| 国产视频一区二区在线看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| a 毛片基地| 亚洲视频免费观看视频| 热99re8久久精品国产| 9191精品国产免费久久| 91字幕亚洲| 深夜精品福利| 69av精品久久久久久 | e午夜精品久久久久久久| 欧美国产精品一级二级三级| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品1区2区在线观看. | 后天国语完整版免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 大型av网站在线播放| 免费不卡黄色视频| 97人妻天天添夜夜摸| 另类亚洲欧美激情| av福利片在线| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精华国产精华精| 青春草亚洲视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲国产精品999| 一区在线观看完整版| 大片免费播放器 马上看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲人成电影观看| 午夜日韩欧美国产| 久久毛片免费看一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 免费人妻精品一区二区三区视频| 男男h啪啪无遮挡| 丝袜喷水一区| 人成视频在线观看免费观看| 看免费av毛片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲成人手机| 日韩电影二区| 日本一区二区免费在线视频| 丝袜脚勾引网站| 亚洲国产精品999| 黄色片一级片一级黄色片| av电影中文网址| 美女中出高潮动态图| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲情色 制服丝袜| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 一级毛片精品| 欧美av亚洲av综合av国产av| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产av国产精品国产| videos熟女内射| 日韩人妻精品一区2区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产成人系列免费观看| 国产av又大| 亚洲av成人一区二区三| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲伊人久久精品综合| 国产精品1区2区在线观看. | 国产野战对白在线观看| 一区二区三区精品91| 黄色毛片三级朝国网站| 国产av一区二区精品久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 在线观看舔阴道视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 热99re8久久精品国产| 五月天丁香电影| 国产91精品成人一区二区三区 | 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美在线黄色| 久久九九热精品免费| 精品高清国产在线一区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 免费不卡黄色视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 成人免费观看视频高清| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲第一av免费看| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品1区2区在线观看. | 91成人精品电影| 视频在线观看一区二区三区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 婷婷成人精品国产| 大型av网站在线播放| 国产99久久九九免费精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲一码二码三码区别大吗| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久国产精品影院| 99国产综合亚洲精品| 国产人伦9x9x在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 中文欧美无线码| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜福利乱码中文字幕| 一本色道久久久久久精品综合| 性色av一级| 丝袜美腿诱惑在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 午夜影院在线不卡| 一区在线观看完整版| 老司机影院成人| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久久国产一区二区| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 午夜日韩欧美国产| 99re6热这里在线精品视频| 精品久久蜜臀av无| 精品人妻1区二区| a在线观看视频网站| 丰满少妇做爰视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 曰老女人黄片| 免费观看人在逋| 国产成人av激情在线播放| 午夜影院在线不卡| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲精品在线美女| 视频在线观看一区二区三区| a级毛片黄视频| 视频区欧美日本亚洲| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品影院久久| 久久香蕉激情| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品自拍成人| a级毛片黄视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 久久久精品免费免费高清| 午夜老司机福利片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 1024视频免费在线观看| 9热在线视频观看99| 久久女婷五月综合色啪小说| av国产精品久久久久影院| 人妻 亚洲 视频| 亚洲av男天堂| 国产精品影院久久| 国产一区二区三区av在线| 欧美日韩av久久| 大陆偷拍与自拍| 久久综合国产亚洲精品| 男女无遮挡免费网站观看| 久9热在线精品视频| 国产精品免费视频内射| 交换朋友夫妻互换小说| 老司机亚洲免费影院| 国产免费现黄频在线看| 一级毛片精品| 啦啦啦 在线观看视频| 伦理电影免费视频| 免费少妇av软件| 午夜老司机福利片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品免费视频内射| 啪啪无遮挡十八禁网站| 在线 av 中文字幕| 91av网站免费观看| netflix在线观看网站| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美另类一区| 在线观看免费视频网站a站| 免费不卡黄色视频| 97在线人人人人妻| 黄色片一级片一级黄色片| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 成人亚洲精品一区在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美大码av| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲熟女毛片儿| 男女免费视频国产| 热99国产精品久久久久久7| 久久女婷五月综合色啪小说| 99久久综合免费| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 天堂8中文在线网| 国产主播在线观看一区二区| 午夜久久久在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 热99re8久久精品国产| 国产成人欧美| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 日本vs欧美在线观看视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产色视频综合| 欧美日韩精品网址| 日韩人妻精品一区2区三区| 免费日韩欧美在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲国产欧美网| 久久久久精品人妻al黑| 国产99久久九九免费精品| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 伦理电影免费视频| 宅男免费午夜| 国产高清国产精品国产三级| a级片在线免费高清观看视频| 高清av免费在线| 亚洲伊人色综图| 国产国语露脸激情在线看| 999精品在线视频| 国产精品偷伦视频观看了| 一级黄色大片毛片| 超色免费av| 国产精品99久久99久久久不卡| 高清黄色对白视频在线免费看| 一本久久精品| 1024香蕉在线观看| 制服人妻中文乱码| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 各种免费的搞黄视频| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲人成电影观看| 超碰97精品在线观看| 国产成人影院久久av| 午夜激情av网站| 久久99一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久久久久久久免费视频了| 精品少妇黑人巨大在线播放| 一级毛片女人18水好多| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲色图综合在线观看| 色94色欧美一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 脱女人内裤的视频| 国产三级黄色录像| 9191精品国产免费久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品熟女久久久久浪| 又大又爽又粗| 亚洲精品在线美女| av福利片在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 极品人妻少妇av视频| 午夜免费成人在线视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 丁香六月天网| 777米奇影视久久| 日韩视频在线欧美| www.熟女人妻精品国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 制服人妻中文乱码| 亚洲国产精品999| 黄片播放在线免费| 亚洲精品美女久久av网站| 国产av国产精品国产| 国产精品九九99| 美女福利国产在线| 丝袜美腿诱惑在线| a级毛片黄视频| 老鸭窝网址在线观看| 久热爱精品视频在线9| 久久久久国内视频| 婷婷成人精品国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 国产伦理片在线播放av一区| 精品国内亚洲2022精品成人 | 久久人人97超碰香蕉20202| 一进一出抽搐动态| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国产真人三级小视频在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产精品一区二区免费欧美 | 国产在视频线精品| 男女免费视频国产| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 后天国语完整版免费观看| 久久久久久久国产电影| 99热网站在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 中国国产av一级| 国产伦理片在线播放av一区| 日日爽夜夜爽网站| 香蕉丝袜av| 99国产精品一区二区三区| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日本av免费视频播放| 亚洲专区中文字幕在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产又爽黄色视频| 国产人伦9x9x在线观看| 黄色视频不卡| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲av日韩在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 一区二区三区精品91| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产一区二区在线观看av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成人三级做爰电影| 国产伦理片在线播放av一区| 男男h啪啪无遮挡| 日韩欧美免费精品| 久热爱精品视频在线9| 久久九九热精品免费| 动漫黄色视频在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产高清videossex| 久久久久精品人妻al黑| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲精华国产精华精| 妹子高潮喷水视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产在线免费精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久综合国产亚洲精品| 午夜福利免费观看在线| 一边摸一边抽搐一进一出视频| a在线观看视频网站| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久久久视频综合| a级片在线免费高清观看视频| av在线播放精品| 国产精品av久久久久免费| 久久久国产精品麻豆| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产亚洲精品久久久久5区| av免费在线观看网站| 成人黄色视频免费在线看| 久久人人97超碰香蕉20202| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲视频免费观看视频| 精品高清国产在线一区| 欧美在线一区亚洲| 999精品在线视频| av片东京热男人的天堂| 国产精品久久久人人做人人爽| 一级毛片女人18水好多| 国产亚洲精品久久久久5区| 久热爱精品视频在线9| 美女主播在线视频| 国产又爽黄色视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 老汉色∧v一级毛片| 极品人妻少妇av视频| 成年动漫av网址| 黄色怎么调成土黄色| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 下体分泌物呈黄色| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 99国产精品免费福利视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 免费看十八禁软件| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 9191精品国产免费久久| 男女边摸边吃奶| 午夜视频精品福利| 久久久国产一区二区| 国产精品二区激情视频| 国产在视频线精品| 亚洲五月婷婷丁香| 91成人精品电影| 中文字幕最新亚洲高清| 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲第一av免费看| 黄色怎么调成土黄色| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲欧美激情在线| av片东京热男人的天堂| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美精品av麻豆av| 成在线人永久免费视频| 亚洲专区国产一区二区| 精品国产一区二区久久| 国产主播在线观看一区二区| 91精品国产国语对白视频| 男女免费视频国产| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲国产欧美在线一区| 国产一区二区三区综合在线观看| 岛国在线观看网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美97在线视频| 国产99久久九九免费精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产一级毛片在线| 成人三级做爰电影| 国产一区二区激情短视频 | 久9热在线精品视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 黑人欧美特级aaaaaa片| 成年美女黄网站色视频大全免费| 婷婷色av中文字幕| 日韩中文字幕视频在线看片| 十八禁网站网址无遮挡| 美女国产高潮福利片在线看| 免费在线观看黄色视频的| 一区福利在线观看| 午夜福利视频精品| 一级,二级,三级黄色视频| 乱人伦中国视频| 正在播放国产对白刺激| 亚洲九九香蕉| 性色av一级| 精品久久蜜臀av无| 啦啦啦 在线观看视频| 9热在线视频观看99| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 午夜91福利影院| 黄片大片在线免费观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品少妇久久久久久888优播| 久久99一区二区三区| 国产高清视频在线播放一区 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 无限看片的www在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美在线黄色| 午夜福利视频精品| 亚洲人成电影观看| 国产精品久久久av美女十八| 午夜免费鲁丝| 亚洲av欧美aⅴ国产| av线在线观看网站| 精品第一国产精品| 亚洲av日韩在线播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| svipshipincom国产片| 欧美日本中文国产一区发布| 手机成人av网站| 久久这里只有精品19| 国产又色又爽无遮挡免| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 久热这里只有精品99| 亚洲欧美一区二区三区久久| 成年人黄色毛片网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 99国产精品99久久久久| 国产成人影院久久av| 亚洲欧美色中文字幕在线| 啦啦啦在线免费观看视频4| 最近最新免费中文字幕在线| 丁香六月天网| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品 国内视频| 国产野战对白在线观看| 久久青草综合色| 色精品久久人妻99蜜桃| 无遮挡黄片免费观看| 窝窝影院91人妻| 丝袜人妻中文字幕| 国产又爽黄色视频| 丝袜美足系列| 欧美精品一区二区免费开放| 精品视频人人做人人爽| 黑人操中国人逼视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 男女无遮挡免费网站观看| 9191精品国产免费久久| 欧美日韩视频精品一区| 午夜福利乱码中文字幕| 人妻人人澡人人爽人人| 最黄视频免费看| 国产一卡二卡三卡精品| 老司机影院成人| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 五月天丁香电影| 少妇人妻久久综合中文| 日本黄色日本黄色录像| 秋霞在线观看毛片|