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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探究喜炎平注射液治療新型冠狀病毒肺炎的作用機(jī)制

    2021-11-08 13:25:06王樂王京璐李智英田夢緣
    關(guān)鍵詞:穿心蓮喜炎抗炎

    王樂,王京璐,李智英,田夢緣

    (邵陽學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 邵陽,422000)

    新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)以發(fā)熱、乏力、干咳為主要癥狀。目前COVID-19并未找到特效藥,主要以隔離治療和對癥治療為主。根據(jù)臨床數(shù)據(jù)表明,中藥治療COVID-19效果較好,患者的治愈率與中藥參與率呈正相關(guān)[1],中藥在COVID-19防治中有不可替代的作用。

    中成藥喜炎平注射液作為《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》推薦治療重型病癥中“氣營兩燔證”使用[2]。喜炎平注射液是由蕨科植物穿心蓮中所提取的活性成分穿心蓮內(nèi)酯,通過磺化生成的穿心蓮內(nèi)酯磺酸鹽滅菌水溶液,具有良好水溶性[3],臨床上主要用于抗病毒、抗炎抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等[4]。

    網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合了多學(xué)科的新興產(chǎn)物,包含了多種數(shù)據(jù)庫檢索、計(jì)算機(jī)模擬、網(wǎng)絡(luò)分析、數(shù)據(jù)分析、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅确椒ǎ越M學(xué)和大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型,探索藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián),并分析闡明了藥物與相關(guān)疾病的相互作用關(guān)系[5]。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)與分子對接研究喜炎平注射液的物質(zhì)基礎(chǔ)及其治療COVID-19的可能作用機(jī)制,同時(shí)也為COVID-19的治療和喜炎平注射液的深入研究提供思路。

    1 材料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

    中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php);UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/downloads);PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://old. swisstargetprediction. ch/);SEA數(shù)據(jù)庫(http://sea.bkslab.org/);GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/);Venny繪圖網(wǎng)站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/);STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/);PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do);Cytoscape3.7.2;OpenBabel-3.1.1軟件;軟件運(yùn)行環(huán)境:PYMOL&AutoDock tools 1.5.6 & AutoDock Vina 1.1.2操作系統(tǒng)。

    1.2 喜炎平注射液主要活性成分篩選及潛在靶點(diǎn)預(yù)測

    本課題以“穿心蓮”為檢索詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取喜炎平注射液的化學(xué)成分,以口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件對在TCMSP中獲得的化合物進(jìn)行篩選,得到喜炎平注射液的活性成分。再利用TCMSP對活性成分進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測,在UniProt數(shù)據(jù)庫中將靶標(biāo)蛋白對應(yīng)Gene Symbol(除去非人源、未經(jīng)驗(yàn)證和重復(fù)的靶點(diǎn)),將篩選的化合物在Pubchem中檢索活性成分14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內(nèi)酯(14-deoxy-12-methoxyandrographolide)與14-去氧穿心蓮內(nèi)酯(14-deoxyandrographolide)的SMLILES,并且在Swiss Target Prediction,SEA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行14-deoxy-12-methoxyandrographolide與14-deoxyandrographolide的潛在靶點(diǎn)預(yù)測,綜合TCMSP,Swiss Target Prediction和SEA數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果,獲取穿心蓮活性成分對應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)。14-去氧-11-氧代-穿心蓮內(nèi)酯與穿心蓮內(nèi)酯-19-β-D-葡萄糖甙無SMLILES,無法檢索出其潛在靶點(diǎn)預(yù)測,故舍去。

    1.3 疾病靶點(diǎn)搜集與潛在治療靶點(diǎn)的獲取

    以“novel coronavirus pneumonia”作為關(guān)鍵詞,檢索Gene Cards數(shù)據(jù)庫,去除重復(fù),獲得COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)。

    1.4 獲取疾病和藥物交集靶點(diǎn)

    使用Venny繪圖網(wǎng)站,將喜炎平注射液潛在作用靶點(diǎn)映射到novel coronavirus pneumonia相關(guān)靶點(diǎn)中,制作Venny圖。將兩者的交集作為喜炎平注射液治療COVID-19的潛在作用靶點(diǎn)。

    1.5 藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    利用1.4中所獲取的治療靶點(diǎn)與對應(yīng)的藥物通過Cytoscape制作出“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,使有效活性成分與疾病核心靶點(diǎn)關(guān)系達(dá)到可視化。

    1.6 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    將1.4所得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中,種屬選擇“Homo sapiens”,置信度得分設(shè)置為0.4,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),并將文件“string_interactions.tsv”導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析,通過度(Degree)值大于平均值來篩選核心靶點(diǎn)。

    1.7 GO富集分析和KEGG通路分析

    利用RStudio的GO_barplot.R和GO_ALL_barplot_count_P.adjust.R腳本對治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析;利用RStudio的KEGGenrich.R和KEGG_bubblePlot.R腳本對治療靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析。

    1.8 分子對接

    利用AutoDock tools 1.5.6對喜炎平注射液中對應(yīng)的活性成分以及關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行半柔性對接,驗(yàn)證相互作用的活性[6],并篩選對接打分結(jié)果。將活性成分跟與COVID-19相關(guān)的SARS-CoV-2 3CL和ACE2進(jìn)行半柔性對接,驗(yàn)證相互作用的活性,給對接結(jié)果進(jìn)行打分。

    具體步驟:(1)從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載活性成分的3D結(jié)構(gòu)文件(SDF格式),用OpenBabel-3.1.1軟件將SDF格式轉(zhuǎn)化成mol2格式,并使用AutoDock tools 1.5.6將mol2格式轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。(2)從PDB數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點(diǎn)的相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白(篩選條件設(shè)為“Homo sapiens”“X-RAY DIFFRACTION”“Protein”),利用PYMOL將靶蛋白的pdb格式去水分子,將蛋白質(zhì)的配體與靶蛋白質(zhì)分離。利用AutoDock tools 1.5.6將已分離出蛋白質(zhì)的配體的靶蛋白質(zhì)與配體的pdb格式轉(zhuǎn)換成pdbqt格式,并確定對接盒子的配體中心與大小。(3)利用vina腳本將活性成分與靶蛋白質(zhì)進(jìn)行對接,并通過對接結(jié)果進(jìn)行打分和作圖。

    2 結(jié)果

    2.1 喜炎平注射液活性成分和潛在靶點(diǎn)

    通過TCMSP檢索穿心蓮,按條件篩選出的活性成分共24個(gè),其中4個(gè)活性成分(表1)與穿心蓮內(nèi)酯有關(guān),其預(yù)測靶標(biāo)數(shù)量共17個(gè)。在Pubchem中檢索活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide與14-deoxyandrographolide的SMLILES,并且在Swiss Target Prediction,SEA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行潛在靶點(diǎn)預(yù)測,綜合TCMSP,Swiss Target Prediction和SEA數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果,獲取穿心蓮活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide與14-deoxyandrographolide的對應(yīng)潛在作用靶點(diǎn)140個(gè)(已去除重復(fù)項(xiàng))。

    表1 穿心蓮主要活性成分基本信息

    2.2 COVID-19的潛在靶點(diǎn)

    通過GeneCards數(shù)據(jù)庫收集到novel coronavirus pneumonia的潛在靶點(diǎn)438個(gè)(已去除重復(fù)項(xiàng))。

    2.3 疾病和藥物交集靶點(diǎn)

    使用Venny繪圖網(wǎng)站,將喜炎平注射液潛在作用靶點(diǎn)140個(gè)映射到novel coronavirus pneumonia相關(guān)靶點(diǎn)438個(gè)中,制作Venny圖(圖1)。將兩者19個(gè)交集靶點(diǎn)作為喜炎平注射液治療COVID-19的潛在作用靶點(diǎn)。

    黑色區(qū)域代表預(yù)測的藥物靶點(diǎn);灰色區(qū)域代表疾病靶點(diǎn)

    2.4 藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    利用1.4中所獲取的治療靶點(diǎn)與對應(yīng)的藥物通過Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。制作出藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。

    圖2 喜炎平注射液治療COVID-19藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

    2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)

    將19個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中,將文件“string_interactions.tsv”導(dǎo)入Cytoscape制作PPI網(wǎng)絡(luò),見圖3(A),圖中19個(gè)潛在靶點(diǎn)存在著66條相互作用。利用NetworkAnalyzer進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,圖中節(jié)點(diǎn)的灰度深淺程度與Degree值呈正相關(guān),灰度越深Degree值越大,見圖3(B)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)Degree平均值為7.33,介值(betweenness centrality,BC)平均值為0.044 117 647。通過Degree值>7.33(平均值)且介值>0.044 117 647(平均值)來篩選核心靶點(diǎn),見表2。

    (A)共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)網(wǎng) (B)核心靶點(diǎn)子網(wǎng)絡(luò)

    表2 喜炎平注射液治療COVID-19的核心靶點(diǎn)表

    2.6 GO和KEGG富集分析

    從生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3個(gè)功能分別進(jìn)行GO富集,各組分排名前10名條目見圖4。通路涉及細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)(cellular response to lipopolysaccharide)和細(xì)胞對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)(cellular response to molecule of bacterial origin),表明喜炎平注射液的靶點(diǎn)主要與抗炎抗菌有關(guān)。

    圖4 潛在靶點(diǎn)的GO富集分析

    KEGG富集通路分析,得到136條通路,取排名前20條通路制作氣泡圖(圖5)、成分靶點(diǎn)通路圖(圖6)。結(jié)果顯示,喜炎平注射液主要通過調(diào)節(jié)人類巨細(xì)胞病毒感染、新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)、甲型流感、TNF等信號通路起到治療COVID-19的作用。

    圖5 潛在靶點(diǎn)的KEGG富集分析

    “V”形節(jié)點(diǎn)為信號通路;圓形節(jié)點(diǎn)為潛在靶點(diǎn);三角形節(jié)點(diǎn)為穿心蓮的有效活性成分

    2.7 分子對接

    根據(jù)2.5的PPI中所分析得到的核心靶點(diǎn)MAPK1,EGFR,MAPK14,JAK1與活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide,14-deoxyandrographolide進(jìn)行分子對接,將活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide,14-deoxyandrographolide與COVID-19相關(guān)的基因靶點(diǎn)SARS-CoV-2 3CL和ACE2進(jìn)行分子對接,見表3。

    從表3中數(shù)據(jù)可知,核心靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合能,其中,以JAK1的結(jié)合效果最佳,具體對接圖見圖7。分子對接結(jié)果表明,喜炎平注射液中的活性成分有較好的抗菌抗炎作用,在COVID-19治療中起了一定的作用。

    表3 分子對接結(jié)果

    (A)1~6依次為14-deoxy-12-methoxyandrographolide與SARS-CoV-2 3CL,ACE2,MAPK14,EGFR,MAPK1,JAK1對接; (B)1~6依次為14-deoxyandrographolide與SARS-CoV-2 3CL,ACE2,MAPK14,EGFR,MAPK1,JAK1對接

    3 討論

    COVID-19以發(fā)熱、乏力、干咳為主要癥狀,重癥患者多在發(fā)病1周后出現(xiàn)呼吸困難和/或低氧血癥,或快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙及多器官功能衰竭。喜炎平注射液是一種穿心蓮制劑,穿心蓮味苦,性寒,具有解熱、降溫、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等作用,主要對癥治療COVID-19的重癥癥狀。

    在本研究中,通過對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究喜炎平注射液治療COVID-19的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)COVID-19重型病癥中“氣營兩燔證”可通過注射中成藥喜炎平注射液進(jìn)行對癥治療,更加確定了中藥在治療COVID-19中的可行性。

    通過對喜炎平注射液治療COVID-19的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可知,該藥的核心活性成分為14-deoxy-12-methoxyandrographolide和14-deoxyandrographolide,并對這兩種活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測,獲得對應(yīng)靶點(diǎn)140個(gè),通過與novel coronavirus pneumonia疾病靶點(diǎn)(438個(gè))進(jìn)行交集,獲得19個(gè)喜炎平注射液治療COVID-19的靶點(diǎn)。對這19個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,可得到與炎癥相關(guān)的核心靶點(diǎn)如MAPK1,EGFR,MAPK14,JAK1。當(dāng)SARS-CoV-2感染人體后,盡管快速的免疫反應(yīng)會成為抵抗病毒感染的第一道防線,但過度的炎性反應(yīng)和受損的宿主免疫防御能力可能會導(dǎo)致組織損傷。尤其是大量的細(xì)胞因子和趨化因子釋放,即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”,清楚地反映了宿主免疫防御的廣泛失控失調(diào)[7],引起急性呼吸窘迫綜合征與多臟器衰竭,甚至引發(fā)患者死亡。核心靶點(diǎn)絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)作為信號從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分,是廣泛調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[8],研究顯示,MAPK成員可通過下調(diào)炎癥因子水平來發(fā)揮其抗炎活性[9-10]。在臨床上,與JAK1基因的表達(dá)密切相關(guān)的烏頭生物堿類藥物用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥[11]。另外,有研究表明,左金方通過下調(diào)JAK1相關(guān)蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抗菌作用,減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,進(jìn)而逆轉(zhuǎn)膿毒癥引起的肺損傷[12]。由此可推測,本研究的核心靶點(diǎn)與炎癥密切相關(guān),對喜炎平注射液治療COVID-19有一定的指導(dǎo)意義。

    通過對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集,對BP條目的分析可知,通路涉及細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)和細(xì)胞對細(xì)菌起源分子的反應(yīng),表示喜炎平注射液的靶點(diǎn)可能與抗炎抗菌有關(guān)。通過對交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析,前20條中有4條通路與病毒、流感、炎癥有關(guān),如人類巨細(xì)胞病毒感染、SARS-CoV-2、甲型流感、TNF信號通路,提示喜炎平注射液可能與抗炎、抗病毒有關(guān),在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,可減輕SARS-CoV-2引起炎性因子釋放和異常增多,減少肝、肺、腎等組織的損傷[13]。其中巨噬細(xì)胞與炎癥相關(guān)反應(yīng)的調(diào)節(jié)有著密不可分的聯(lián)系,有研究表明,喜炎平注射液通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抑制細(xì)胞分泌TNF等炎性因子從而發(fā)揮抗炎作用[14]。在臨床研究中,膿毒癥重癥患者外周血中的TNF-α水平均高于其他患者,由此可見,人體中TNF含量與膿毒癥有較大聯(lián)系[15],喜炎平注射液可通過抑制TNF信號通路來抑制和治療COVID-19引起的炎癥反應(yīng)和膿毒癥。所以,喜炎平注射液可能通過抑制COVID-19患者體內(nèi)的炎癥因子風(fēng)暴、過度的免疫反應(yīng)等從而發(fā)揮治療COVID-19的功效。

    研究發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2與病毒SARS-CoV有著高達(dá)79.5%的同源性,二者受體均為ACE2[16]。ACE2作為SARS-CoV-2細(xì)胞內(nèi)受體是SARS-CoV-2感染并入侵機(jī)體的關(guān)鍵基因[17]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的方法,從蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中篩選Degree值、介值均高于平均值的靶點(diǎn)與中藥穿心蓮中的活性成分對接。研究表明,配體與受體結(jié)合時(shí)所需的結(jié)合能越低,發(fā)生作用的可能性越大,結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定[18]。結(jié)合能>-5.0 kcal/moL,說明分子與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性,親和力高;結(jié)合能>-0.7 kcal/moL,則說明分子與靶點(diǎn)的結(jié)合構(gòu)型具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[19],親和力強(qiáng)。結(jié)果顯示,14-deoxy-12-methoxyandrographolide和14-deoxyandrographolide與SARS-CoV-2 3CL,ACE2核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均<-5.0 kcal/moL,具有較好的結(jié)合活性,與炎癥相關(guān)基因JAK1的結(jié)合能較其他基因更牢固,故推測活性成分對炎癥有較好療效。

    綜上所述,喜炎平注射液可能通過抗病毒、抗炎等相關(guān)通路來治療COVID-19。本研究初步確定了喜炎平注射液治療COVID-19的活性成分及其核心靶點(diǎn)的組成,為臨床合理應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

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