健康人血清四環(huán)素、磺胺類抗生素水平及內(nèi)暴露概率評估

賀棟梁，李靜娜，龍彩虹，吳成秋

(1.衡陽市中心醫(yī)院，湖南 衡陽，421001；2.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽，421001；3.武漢市疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢，430015；4.衡陽市疾病預(yù)防控制中心，湖南 衡陽，421001)

自四環(huán)素、磺胺類等廣譜抗生素被用于醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)及農(nóng)業(yè)以來，土壤、動物糞便和牛奶產(chǎn)品等被相繼報道有抗生素殘留[1-2]，已開展系列研究構(gòu)建，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)同步檢測方法，監(jiān)測動物性食品四環(huán)素[3]、磺胺類[4]等抗生素污染狀況。前期研究雖然提供了抗生素同步檢測方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)集，但該數(shù)據(jù)集僅能反映人群抗生素外暴露的可能，而內(nèi)暴露水平則可綜合反映外來化學(xué)物濃度、生物富集系數(shù)、人體吸收、代謝及排泄等多因素、全過程作用的結(jié)局，因此更具有實際意義。據(jù)此，本文檢測33例健康人血清四環(huán)素及磺胺類抗生素含量，對檢出率高的抗生素行Monte Carlo概率模擬，以評估人群內(nèi)暴露水平。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

2020年11月至12月，預(yù)約預(yù)防性健康檢查，擬從事食品、飲用水、化妝品生產(chǎn)及公共場所直接為顧客服務(wù)的人員，經(jīng)篩選后共獲得血清樣本33份。其中男性9例，年齡(29.33±8.69)歲；女性24例，年齡(35.75±11.54)歲。男、女性別間年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.51，P=0.141)。納入標準：(1)知情同意；(2)近3個月內(nèi)未使用過抗生素；(3)體檢結(jié)果符合從業(yè)人員健康要求。排除標準：(1)肝腎功能障礙；(2)既往精神疾病史。

1.2 樣本預(yù)處理

取血液樣本3 mL，加入乙腈2 mL后，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入0.1 mol/L的EDTA-Mcllvaine緩沖液10 mL后，順序進行1 000 r/min渦旋1 min、超聲提取10 min、10 000 r/min離心10 min，收集首次提取液后并重復(fù)一次緩沖、渦旋、超聲、離心等過程，2次提取液合并。

1.3 固相萃取柱的活化及LC-MS/MS檢測

HLB固相萃取小柱依次用甲醇和超純水各6 mL活化，上樣后用5%甲醇水溶液3 mL淋洗，甲醇6 mL洗脫目標物并收集洗脫液，經(jīng)弱氮氣流吹干后以蒸餾水定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機行LC-MS /MS檢測。色譜條件、質(zhì)譜條件參照LC-MS/MS同步檢測四環(huán)素類、磺胺類抗生素方法[3-4]設(shè)置。質(zhì)量控制措施包括同步測定全過程空白、測定空白和基質(zhì)加標回收率等，每測定10個血清標本時，測定標準參照物(購自美國 Sigma 公司)并將結(jié)果加入標準曲線校正斜率。

1.4 Monte Carlo概率模擬

基于33例血清樣本抗生素含量的檢測數(shù)據(jù)，運用Oracle Crystal ball軟件模擬高檢出率抗生素的最優(yōu)分布，以最優(yōu)模擬分布的參數(shù)為指標，轉(zhuǎn)入軟件迭代計算5 000次以模擬計算機抽樣，產(chǎn)生大樣本數(shù)據(jù)后計算不同抗生素內(nèi)暴露水平下的人群累積概率風(fēng)險。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 色譜圖、標準曲線、加標回收率及相對標準偏差

在選定色譜條件下，混合標準系列中的抗生素可完全分離，色譜峰型尖峭，無雜峰。擬合抗生素組分的標準曲線分別為金霉素(CTC)：y=111.719x-54.776，r2=0.998；土霉素(OTC)：y=66.575x-5.438；r2=0.997；多西環(huán)素(DOX)：y=585.022x-1157.01，r2=0.997；四環(huán)素(TC)：y=137.761x+157.319，r2=0.999；磺胺甲噻二唑(STZ)：y=22.002x-19.730，r2=0.997；磺胺二甲基嘧啶(SM2)：y=361.07x-21.503，r2=0.999；磺胺吡啶(SPD)：y=236.139x+303.357，r2=0.998；磺胺甲惡唑(SMZ)：y=203.771x-48.486，r2=0.999；磺胺氯噠嗪(SCP)：y=245.941x-218.249，r2=0.998；磺胺甲基嘧啶(SM)：y=177.167x-34.310，r2=0.999；磺胺異惡唑(SIA)：y=175.803x+13.239，r2=0.999。不同組分的加標回收率介于85.62%～113.84% ，RSD為0.6%～7.5%。

2.2 抗生素檢出率及檢出水平

表1和表2顯示，受檢的11種目標抗生素中，4種四環(huán)素及2種磺胺類抗生素有檢出，呈偏態(tài)分布，檢出率高低順位依次為金霉素(CTC)>磺胺甲噻二唑(STZ)>磺胺甲惡唑(SMZ)>四環(huán)素(TC)>多西環(huán)素(DOX)>土霉素(OTC)，檢出陽性的抗生素性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此外，磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺甲基嘧啶(SM)、磺胺異惡唑(SIA)等5種磺胺類抗生素未檢出。

表1 血清抗生素檢測陽性例數(shù)

表2 血清CTC,STZ,SMZ,TC,DOX,OTC等抗生素含量

2.3 不同抗生素含量Spearman關(guān)聯(lián)與檢出率Kappa系數(shù)

對檢測陽性抗生素組分行Spearman 相關(guān)性分析，未見抗生素間存在等級相關(guān)性(P>0.05)，見表3。此外，Kappa系數(shù)計算結(jié)果表明，不同抗生素在同一血清中的檢出結(jié)果并無一致性(P>0.05),見表4。

表3 不同抗生素含量的Spearman相關(guān)性

表4 不同抗生素檢出的一致性

2.4 內(nèi)暴露水平的Monte Carlo模擬

對檢出率高、符合概率模擬條件的抗生素進行概率模擬，結(jié)果表明,其內(nèi)暴露水平服從Logistic,Min Extreme,Beta等不同分布類型，見表5。累積概率圖示50%及95%個體的5種抗生素內(nèi)暴露水平分別為CTC(1.71和4.22 g/mL)，DOX(0.21和1.25 g/mL)，TC(1.64和3.51 g/mL)，STZ(0.88和1.76 g/mL)，SMZ(0.50和1.00 g/mL)等，見圖1。

表5 血清5種抗生素含量的最佳擬合分布類型及P50,P95水平

圖1 5種抗生素不同內(nèi)暴露水平下的累積概率

3 討論

抗生素因被濫用而演變成全球公共衛(wèi)生問題[5]?，F(xiàn)有的限制抗生素濫用政策主要是針對臨床和醫(yī)源性，如要求臨床應(yīng)用實行抗菌藥物分級管理[6]、三級醫(yī)院停止兒科以外門診患者輸注抗菌藥物等，而濫用導(dǎo)致非醫(yī)源性暴露的潛在危害極少關(guān)注。本次檢測不同年齡、不同性別、未經(jīng)臨床用藥的健康人血清， CTC,STZ,SMZ,TC,DOX,OTC等抗生素被檢出，提示抗生素可經(jīng)非醫(yī)源性暴露途徑如環(huán)境因素、食物鏈等無差別轉(zhuǎn)移進入人體，導(dǎo)致潛在的健康風(fēng)險。因此，在規(guī)范抗生素臨床應(yīng)用的同時，控制環(huán)境介質(zhì)污染所致的非醫(yī)源性暴露同具重要意義。

Monte Carlo概率評估方法用于風(fēng)險與暴露評估的合理性得到國際公認，它能有效解釋暴露時個體吸收、代謝能力變異性及接觸途徑、劑量不確定性[7]。本次運算邏輯是利用專業(yè)軟件Crystal Ball的內(nèi)置程序步，模擬檢測陽性抗生素在血清中的分布類型，有效描述了該分布的參數(shù)轉(zhuǎn)入后續(xù)計算程序步迭代計算。計算全過程采用隨機抽樣的方法，計算機模擬抽樣則由迭代計算實現(xiàn)，更好地模擬了人群中不同個體在外暴露程度、機體代謝與排泄能力不同時的隨意性和不確定性。此外，隨著計算迭代次數(shù)的不斷增加，也間接起到了樣本放大的作用，進而使估計值更趨于穩(wěn)定。

過度使用抗生素破壞腸道微生態(tài)[8]、誘發(fā)耐藥性[9]及增加過敏風(fēng)險[10]等暴露風(fēng)險多有報道，本研究中同一血清樣本檢出多種抗生素的事實說明，針對單一抗生素健康風(fēng)險的探索忽略了多組分共存時的聯(lián)合效應(yīng)，可能并不契合人們多途徑、多組分同時暴露的客觀規(guī)律。本監(jiān)測得到的單一抗生素含量數(shù)據(jù)，若可基于某種“危害等效系數(shù)”換算，可更好地反映抗生素內(nèi)暴露的整體水平，對其潛在危害的風(fēng)險評估、預(yù)判和控制工作具有更重要的意義。據(jù)此認為，契合人群多途徑、多組分共暴露抗生素的特點，不同抗生素健康危害的等效性研究有望成為新的研究熱點。