合浦珠母貝nacrein基因真核表達載體構建及生物信息學分析

劉鵬，蘭太進，楊宇華，楊大航，焦揚，李論，黎睿，林江

(廣西中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，廣西 南寧，530200)

合浦珠母貝(Pinctadafucata)又名馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)，盛產于我國廣西北海合浦。合浦珠母貝外套膜對珍珠和貝殼的形成起重要作用，在正常生理條件下外套膜分泌外液形成貝殼；而當表皮細胞受傷或受到外來刺激后，表皮細胞發(fā)生病理變化，形成珍珠囊，繼而分泌珍珠質形成珍珠[1-2]。合浦珠母貝貝殼有3層，由內至外分別為珍珠層、棱柱層和角質層，其中，珍珠層和珍珠的化學組成和結構基本相同，由95%以上的文石型碳酸鈣和低于5%的有機基質組成[3]。Nacrein蛋白是第1個被確認的軟體動物有機基質成分，被認為與珍珠層的形成有關[4]。Nacrein是一種水溶性基質蛋白，存在多種軟體動物的貝殼中，如合浦珠母貝的貝殼和珍珠，長牡蠣(Crassostreagigas)、蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)、巖牡蠣(Crassostreanippona)等的貝殼[4-5]。合浦珍珠作為一種傳統(tǒng)名貴中藥，具有鎮(zhèn)靜安神、養(yǎng)陰熄風、清熱解毒、明目去翳、解毒生肌、美容和抗衰老等功效[6]。本課題組比較關注合浦珍珠抗菌功效，前期發(fā)現合浦珍珠提取物具有顯著的體外抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌和綠膿桿菌的活性[7-8]，吳燕燕等[9]報道合浦珠母貝肉風味蛋白酶酶解肽具有顯著抗菌效果，石耀華等[10]從馬氏珠母貝腹足中克隆出一個推測的腫瘤抑制因子，但迄今為止，關于合浦珠母貝相關的具體藥效物質基礎研究比較薄弱?；谇捌趶暮掀终渲榉鬯苄蕴崛∥镏需b定到大量的Nacrein蛋白(由蘭太進副教授提供數據)，本研究通過提取合浦珠母貝肉RNA，反轉錄獲得cDNA，從中克隆出nacrein基因，構建到真核表達載體pPICZαA上，并進行生物信息學分析，為后續(xù)深入探討合浦珍珠抗菌活性物質基礎提供一定的理論和數據基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

樣品采自廣西壯族自治區(qū)北海市合浦縣的合浦珠母貝肉，分裝后保存于-80 ℃冰箱中；所用pPICZαA空載體、大腸桿菌DH5α均為廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學創(chuàng)新綜合實驗室保存。

總RNA提取試劑RNAiso Plus(Code: 9108Q)、反轉錄試劑盒PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit(Code:6110A)均購自大連Takara公司；高保真Pfu mix(Code:P2022)、質粒提取試劑盒(Code:N1011)均購自廣州東盛生物科技有限公司；DiaSpin柱式PCR產物純化試劑盒(Code:B110093)、引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；博來霉素(Code:SL4140)購自北京酷來搏科技有限公司；限制性內切酶EcoR I-HF星選酶(Code:R3101T)、XbaI星選酶(Code:R0145V)均購自NEB(北京)有限公司。

XY-SH-150-III型智能生化培養(yǎng)箱、XY-JH-11C型單人單面凈化工作臺(上海昕儀儀器儀表有限公司)；THZ-300C型恒溫搖床(可制冷)(上海一恒科技有限公司)；T100TMThermal Cycler梯度PCR儀、GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；5418型臺式離心機(德國Eppendorf公司)；EPS300型電泳儀(上海天能科技有限公司)；YXQ-LS-100A型內循環(huán)式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學儀器有限公司)；NanoDropTMOne/OneC型超微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Nanodrop公司)。

1.2 方法

1.2.1 合浦珠母貝nacrein基因克隆

使用RNAase滅活的普通手術剪將-80 ℃冰箱中保存的合浦珠母貝肉剪碎，加液氮快速研磨成粉，使用RNAiso試劑提取總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄cDNA第一鏈，稀釋10倍作為PCR擴增模板，保存于-20 ℃冰箱中。根據nacrein基因(GenBank登錄號: D83523.1)，設計合成上游引物5′-GGAATTCATGTATCTTCATTTGACTGCCCT-3′，下劃線部分為EcoRI限制性內切酶位點以及在5′端添加保護堿基G，下游引物5′-GCTCTAGATTTGAAGCTTTTGTACACAGTAAC-3′，下劃線為XbaI限制性內切酶位點以及在5′端添加保護堿基GC。

以合浦珠母貝肉cDNA為模板，采用高保真DNA聚合酶Pfu mix PCR擴增目的基因。擴增體系如下：2×Pfu mix 25 μL，上游引物F(10 μmol/L)1 μL，下游引物R(10 μmol/L)1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 22 μL，反應總體積為50 μL。反應條件如下：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)，72 ℃后延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用PCR產物回收試劑盒回收純化[11]。

1.2.2 重組真核表達載體構建

將純化回收的PCR產物和真核表達載體pPICZαA分別經EcoR I和XbaI雙酶切，回收酶切片段，酶切載體片段與酶切目的片段按1∶3混合，用T4 DNA連接酶連接，42 ℃熱激法轉入E.coliDH5α化學感受態(tài)細胞，復蘇后涂布到含終濃度100 μg/mL博來霉素的低鹽LB固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，使用載體引物進行PCR驗證，并經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。挑取陽性克隆子，接種到含終濃度100 μg/mL博來霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質粒，送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序[12]。

1.2.3 生物信息學分析

使用ExPASy提供的在線工具Protparam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對合浦珠母貝Nacrein蛋白進行理化性質分析；TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測Nacrein跨膜結構域；SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測Nacrein信號肽；Pfam(http://pfam.xfam.org/)在線預測Nacrein結構域[13]，并用DOG 2.0繪制蛋白質功能結構域示意圖[14]；使用ExPASy提供的PeptideCutter在線工具(https://web.expasy.org/peptide-cutter/)預測合浦珠母貝Nacrein蛋白可能的酶切位點；CAMPR3(www.camp.bicnirrh.res.in/index.php)預測蛋白質理論抗菌降解肽段[15]；NetPhos3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)查找Nacrein蛋白磷酸化位點[16]；NetNGlyc1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)查找Nacrein蛋白糖基化位點[17]；SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線預測Nacrein蛋白二級結構；I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)在線預測蛋白質三級結構[18]。

2 結果

2.1 合浦珠母貝nacrein基因擴增結果

合浦珠母貝nacrein基因PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見一條約1 344 bp特異條帶，大小與預期一致，見圖1?；厥占兓螅汵anoDropTM One/Onec超微量核酸檢測儀檢測，其質量濃度為42.1 ng/μL，OD260/OD280為1.86，濃度雖然有些低，但純度可以，可用于后續(xù)試驗。

M為DNA分子量marker DSTM 5000 ladder；1,2號為合浦珠母貝nacrein基因PCR擴增產物

2.2 pPICZαA-nacrein真核表達載體的構建及鑒定

酶連產物轉入DH5α化學感受態(tài)細胞后復蘇培養(yǎng)，對長出來的單菌落使用通用載體引物進行PCR驗證，結果見圖2，1～7號可見一條含目的基因及部分載體片段的特異條帶，大小約1933 bp，為目的陽性克隆子。提取3個陽性克隆子質粒進行測序，結果表明,克隆的nacrein基因序列與GenBank報道的序列一致，見圖3。

圖3 合浦珠母貝Nacrein蛋白氨基酸序列

2.3 生物信息學分析結果

ExPASy ProtParam在線分析軟件分析Nacrein蛋白的分子式為C2162H3289N667O682S18，預測分子量約為50.11 kD，理論等電點pI為6.83，含56個帶負電荷的氨基酸殘基及53個帶正電荷的氨基酸殘基。其蛋白質不穩(wěn)定系數為22.88<40.00，為穩(wěn)定蛋白質，總平均親水性(GRAVY)為-1.044<0，為親水蛋白質。TMHMM結果顯示,Nacrein蛋白不存在跨膜結構域，且主要定位于細胞外，見圖4。

圖4 TMHMM預測合浦珠母貝Nacrein蛋白跨膜結構域

SignalP-5.0 Server信號肽預測結果顯示,信號肽的概率(signal peptide probability,SP)值為0.996 1，表明存在信號肽，切割位點在17和18位氨基酸之間(CYG-AS之間)，見圖5。

圖5 合浦珠母貝Nacrein蛋白信號肽切割位點分析

Pfam在線預測蛋白質結構域，并用DOG 2.0繪制蛋白質功能結構域示意圖，見圖6，其N端存在一個碳酸酐酶結構域I(carbonic anhydrase，CA-I)，C端亦存在一個碳酸酐酶結構域II(CA-II)，中間存在一個Gly-Xaa-Asn(GXN，X=Asp、Asn或Glu)的重復結構域。

圖6 合浦珠母貝Nacrein蛋白功能結構域示意圖

PeptideCutter預測結果顯示，合浦珠母貝Nacrein蛋白可能存在154個蛋白酶K酶切位點，50個胰蛋白酶酶切位點，說明Nacrein蛋白易被蛋白酶酶解為不同大小的肽段。CAMPR3預測合浦珠母貝Nacrein蛋白理論抗菌降解肽段，經SVM，Random forest，Artificial Neural Network和Discriminant Analysis等模塊預測皆為抗菌肽段的有4條，CA-I區(qū)域1條，CA-III區(qū)域3條，具體結果見表1。

表1 合浦珠母貝Nacrein蛋白抗菌降解肽段的預測

如圖7所示，Nacrein蛋白含有30個可能的磷酸化位點。絲氨酸(S)10個，其中1號抗菌降解肽段的S82，2號的S337，3號的S407，4號的S445可能存在磷酸化修飾。蘇氨酸(T)11個，其中4號抗菌降解肽段的T431，T435，T441可能存在磷酸化修飾。酪氨酸(Y)9個，4個抗菌降解肽段均不存在酪氨酸磷酸化位點,見圖7(A)。Nacrein蛋白N-糖基化位點只有44號氨基酸一處，為N44E45T46，見圖7(B)，說明Nacrein蛋白磷酸化程度高而糖基化程度低。

圖7 合浦珠母貝Nacrein蛋白磷酸化(A)和N-糖基化(B)位點分析

SOPMA在線軟件預測合浦珠母貝Nacrein蛋白二級結構，結果顯示，其主要結構為無規(guī)卷曲，占55.03%；其次為α-螺旋(19.46%)；延伸鏈(16.34%)；β-轉角(9.17%)。同時，利用I-TASSER工具進行三維結構同源建模，其中無規(guī)卷曲最多，與二級結構一致，見圖8(A)。所預測的4條抗菌降解肽段主要位于Nacrein蛋白表面，見圖8(B)。

1-ISKCFIACGIGQRQSPINIV肽段所在區(qū)域；2-GENGHKHGCRVKKAKHLSRI所在區(qū)域；3-WVVQKCHVQVSRRVLHALRN；4-RKYGTRRPTQKNKVTVYKSF

3 討論

由合浦珠母貝所產的合浦珍珠(又稱南珠)在我國已有兩千多年的藥用歷史，一直被奉為純天然養(yǎng)顏美容、功能性食品和道地藥材，是有營養(yǎng)價值和生物活性成分的重要來源。珍珠主要由95%以上的碳酸鈣和5%以下的有機質組成，其中有機質包括小分子多肽、多糖、核酸、各種必需氨基酸、10多種與人體新陳代謝相關的氨基酸以及一些具有特殊生理活性的非蛋白質氨基酸(如?；撬岬?；卟啉及金屬卟啉物質；B族維生素；另外還含有銅、鐵、鎂、錳、鈉、鋅、鍶等微量元素，種類齊全，且比例組合形式符合人體需要[7, 19-20]。而目前對合浦珍珠小分子肽或者蛋白質類藥物研究尚少，本課題組前期實驗結果表明，合浦珍珠粉水溶性提取物富含Nacrein蛋白，因此，以Nacrein為研究對象，深入挖掘其生物學功能。

通過基因工程實驗方法成功克隆獲得nacrein基因，并將之構建到真核表達載體上，且進行生物信息學分析。該蛋白質為分泌型親水性蛋白質，溶解性良好，在N端和C端各存在一個碳酸酐酶結構域，中間存在一個Gly-Xaa-Asn重復結構域，具有碳酸酐酶催化活性和結合鈣離子能力，對珍珠質和貝殼的形成具有重要作用[5]。Nacrein蛋白在珍珠水溶性基質中占比很大，主要功能是生物礦化[4]，但前期發(fā)現合浦珍珠提取物具有顯著抑菌活性，提示Nacrein應該還具有其他生物功能，目前，已有文獻[21-23]報道，珍珠水解液里面富含生物活性肽，具有體外抗氧化、美白、抗血管緊張素轉化酶活性，蛋白酶切位點預測顯示Nacrein蛋白具有諸多蛋白酶切位點，容易被水解為不同大小的降解肽段。通過AntiBP Server，CAMP，APD2預測凡納濱對蝦血藍蛋白可能的抗菌降解肽，發(fā)現12條可能的抗菌肽，采用化學合成后均表現出明顯的抗菌活性，說明結合生物信息學開發(fā)新型的蛋白質抗菌降解肽段是一種行之有效的策略[24-25]。通過CAMPR3預測到合浦珠母貝Nacrein蛋白理論抗菌降解肽段有4條，CA-I區(qū)域1條，CA-III區(qū)域3條， 且存在多個可能的磷酸化位點，可以推測上述4條預測的抗菌降解肽經磷酸化修飾后，可能會影響其生物學功能。通過三維結構發(fā)現這4條肽段主要位于Nacrein蛋白表面，易被蛋白酶識別水解釋放出來。

總之, 本研究從合浦珠母貝中克隆出nacrein基因,構建到真核表達載體pPICZαA上，并對其進行了生物信息學分析，為后續(xù)深入開發(fā)Nacrein蛋白功能提供了一定的理論和實驗數據。