響應面法優(yōu)化槐米中蘆丁的提取工藝研究

姚佳，潘利平，龍應霞，張歡歡

（黔南民族師范學院 生物科學與農(nóng)學院，貴州都勻 558000）

槐米為豆科植物槐（Sophora japonciaL.）的干燥花蕾，槐米中富含蘆丁和槲皮素等黃酮類成分，其中主要活性成分為蘆丁[1]。蘆丁具有抗病毒、舒張血管、抗自由基活性、抗脂質過氧化、拮抗血小板活化因子聚集、抗急性胰腺炎、胃潰瘍的預防性保護等作用，醫(yī)藥工業(yè)中常以槐米為主要原料提取蘆丁，銷往日本、東南亞和歐美等國家和地區(qū)[2-3]。

已有研究人員分別采用水提法、堿溶酸沉法、超聲波法等方法提取槐米蘆丁，并采用正交法、響應面法考察了槐米粉碎度、提取時間、溶劑用量、提取次數(shù)、超聲波功率以及料液比等因素對蘆丁得率的影響[4-9]。目前還沒有超聲波輔助堿溶酸沉法提取槐米蘆丁的報道，因此本研究通過考察超聲波時間、酸沉pH值、超聲溫度等因素對蘆丁提取的影響，以期找到一條穩(wěn)定可靠的蘆丁提取工藝。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

槐米，安國市旭芳中藥材經(jīng)營有限公司；濃鹽酸，分析純，固安縣金榮化工有限公司；生石灰，購自都勻市場。

pH838測試筆，?，攦x表；CJ-G040超聲波提取器，深圳市超潔科技實業(yè)有限公司；FCR2002-UF-P超純水機，青島富勒姆科技有限公司；GXZ-9140MBE鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；CP214分析天平，奧豪斯儀器有限公司；ZA-2型粉碎機，金壇市科析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁的提取

取干燥槐米30 g，粉碎，過100目篩，加入澄清石灰水，超聲提取，趁熱抽濾，取濾液，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值，室溫靜置，抽濾，得黃色沉淀，用水洗滌至中性，冷凍干燥得粗蘆丁，將干燥后的粗蘆丁加入一定量的蒸餾水，用飽和石灰水調(diào)pH值至8～9，充分溶解后趁熱抽濾，濾液加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值2左右，靜置，冷卻后抽濾，并用蒸餾水洗至中性，烘干后得精制蘆丁，稱重，計算蘆丁得率。

其中：m為提取蘆丁質量，g；M為槐米質量，g。

1.2.2 單因素試驗

通過查閱文獻和前期試驗摸索，稱取30 g槐米粉末，以蘆丁得率為響應值，探究超聲時間（10 min、20 min、30 min、40 min和50 min）、酸沉pH值（1.0、2.0、3.0、4.0和5.0）、超聲溫度（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃）3個單因素對蘆丁得率的影響，確定各因素對蘆丁提取的最佳范圍。

1.2.3 響應面設計

在單因素試驗的基礎上，利用Design-Expert 11.0軟件，選擇超聲時間（A）、酸沉pH值（B）、超聲時間（C）3個因素為因變量，蘆丁提取率（Y）為響應值，設計3因素3水平的Box-Behnken實驗，合計12個析因點，3個中心重復試驗，共計15次試驗進行蘆丁提取的優(yōu)化，結果再進行方差分析，考查試驗的可行性，最后通過預測和試驗驗證優(yōu)化工藝的可行性和準確性。

1.2.4 數(shù)據(jù)和圖形處理

每個單因素試驗隨機重復3次，結果均以均值±標準差（±s）表示，單因素試驗結果采用Origin 2018對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和圖形處理，響應面優(yōu)化采用Design-Expert 11.0軟件進行響應面設計、方差分析和結果預測。

1.2.5 驗證實驗

采用Design-Expert 11.0軟件預測的試驗工藝，進行3次平行實驗，取平均值，計算標準差，以驗證模型是否可靠，進而得到最優(yōu)結果。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

固定超聲溫度100 ℃、酸沉pH值3，由圖1（a）可知，浸提時間在10～40 min時，隨著時間的推移，蘆丁提取率逐漸升高，在40 min時，蘆丁提取率達到最大值，然后隨著時間的增加蘆丁提取率降低，因此選擇40 min作為蘆丁的最佳浸提時間。

圖1 超聲時間、酸沉pH值、超聲溫度對蘆丁提取率的影響

固定超聲提取溫度100 ℃、提取時間40 min，由圖1（b）可知，當pH值為1.5時蘆丁的提取率最高，同時通過調(diào)節(jié)pH發(fā)現(xiàn)，當pH＜3時出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象最為明顯，因此單因素試驗的范圍選擇在pH值1.0～2.5，并選擇pH為1.5作為蘆丁提取的最適pH。

固定超聲提取時間40 min，酸沉pH 1.5，研究不同提取溫度對蘆丁提取率的影響，結果如圖1（c）所示。在溫度60～70 ℃，蘆丁的得率變化較小，70～80 ℃略有增加，80～90 ℃后急劇增加，100 ℃后又降低，說明溫度對蘆丁的提取影響比較大。單因素試驗表明：超聲時間為40 min，酸沉pH為1.5，提取溫度90℃時為較優(yōu)參數(shù)，可作為響應面的設計優(yōu)化的試驗基礎。

2.2 響應面實驗結果

采用-1、0、1進行編碼，以超聲時間（A）、酸沉pH值（B）、超聲溫度（C）為因素變量水平，蘆丁得率（Y）為響應值，利用Design-Expert 11.0版本軟件進行實驗設計，各因素編碼水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素及編碼水平設計

根據(jù)Box-Behnken Design試驗因素及編碼水平，設計12個析因點實驗，3個中心重復實驗，設計方案及實驗結果如表2。

表2 Box-Behnken實驗設計及實驗結果

對表2進行回歸模型方差分析，結果見表3。從表3可知，回歸模型的P＜0.05，回歸模型顯著，說明蘆丁得率與超聲時間、酸沉pH值、超聲溫度的二次多項式回歸模型方程可用；失擬項的P＞0.05，失擬項不顯著，說明方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，蘆丁得率與超聲時間、酸沉pH值、超聲溫度關系良好。

表3 回歸模型的方差分析

通過回歸分析，得到二次多項回歸模型方程為：Y=11.3-0.3353A-0.2043B+0.3465C+0.7078AB+0.5472AC+0.1147BC-2.47A2-2.52B2-3.43C2。

采用Design-Expert 11.0版本的軟件，做3D響應面分析得到圖2。由圖2可知，超聲時間與酸沉pH值、超聲時間與超聲溫度、酸沉pH值與超聲溫度之間均出現(xiàn)了先增加后降低的趨勢，3D響應面圖中均出現(xiàn)了爬坡最高點，3D響應面在底面的投影為二維等高線圖，由底部的二維等高線圖可知，等高線均出現(xiàn)了圓形或橢圓形，蘆丁的提取具有最高中心點，說明響應面提取蘆丁優(yōu)化完成，可以進一步采用該方法進行提取蘆丁的優(yōu)化預測。

圖2 超聲時間、酸沉pH值、超聲溫度相互之間的3D響應面圖

2.4 蘆丁工藝優(yōu)化預測與驗證試驗結果

采用Design-Expert 11.0中的Optimization（優(yōu)化）功能，蘆丁得率目標期望獲得最大值，超聲時間、酸沉pH值、超聲溫度均選擇在一定范圍內(nèi)，在該模式下，預測工藝為超聲時間39.295 min、酸沉pH值1.475、超聲溫度90.444 ℃，蘆丁期望值為11.323%。為方便試驗，選擇超聲時間39 min，酸沉pH值1.5，超聲溫度90 ℃，通過3次工藝試驗驗證，蘆丁提取率為（10.329±1.961）%。

如果希望盡可能節(jié)約能量資源而獲得較高的蘆丁提取率，工藝中溫度與時間越低，消耗的能量就越低，因此Optimization（優(yōu)化）功能下還可以選擇超聲時間和超聲溫度的優(yōu)化目標選擇最小取值范圍，酸沉pH值與能量無關，選擇在設置范圍內(nèi)，蘆丁得率目標期望得率選擇最大范圍內(nèi)。在該模式下，預測工藝為超聲時間32.553 min、酸沉pH值1.421、超聲溫度84.905 ℃，蘆丁提取率期望值為9.379%。通過試驗驗證，選擇超聲時間33 min，酸沉pH值1.4，超聲溫度85 ℃，蘆丁提取率為（9.113±0.139）%，對槐米中的蘆丁仍然具有較高的提取率。

3 結論

通過單因素試驗設計，篩選獲得超聲輔助提取法中超聲時間、酸沉pH值、超聲溫度為影響蘆丁得率的關鍵因子，再利用響應面聯(lián)合Box-Behnken試驗設計和Optimization獲得兩條優(yōu)化工藝，優(yōu)化工藝為超聲時間39 min、酸沉pH值1.5、超聲溫度90 ℃，通過3次工藝試驗驗證，蘆丁提取率為（10.329±1.961）%。經(jīng)驗證，響應面優(yōu)化獲得槐米蘆丁的提取工藝穩(wěn)定可靠。