HPLC法測(cè)定蒲黃鎮(zhèn)痛活性提取物的含量

唐倩男，謝云秀，王晉思，胡圳春，吳昭全

（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410219）

蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲（Typha angustifoliaL.）、東方香蒲（Typha orientalisPresl）或同屬植物的干燥花粉[1]，具有促進(jìn)體內(nèi)循環(huán)和降低血脂進(jìn)而阻止高脂血癥所致的血管內(nèi)皮損傷，防止動(dòng)脈粥樣硬化等作用[2-3]。《本草綱目》中記載，蒲黃有消瘀活血、止痛止血等功效，目前在蒲黃祛瘀止血方面有較多的

報(bào)道，對(duì)止痛效果研究較少。曾光堯等[4]研究證明，蒲黃95%乙醇提取物具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性，將蒲黃具有鎮(zhèn)痛作用的成分先經(jīng)大孔樹脂再經(jīng)聚酰胺柱分離純化，發(fā)現(xiàn)香蒲新苷為其主要鎮(zhèn)痛成分，但并未對(duì)其鎮(zhèn)痛活性的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定蒲黃中95%乙醇提取物中鎮(zhèn)痛成分香蒲新苷的含量，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器

P1100型HPLC高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；D1100紫外-可見檢測(cè)器，大連依利特分析儀器有限公司；YP6002B電子天平，上海力辰邦西儀器科技有限公司；KQ-300E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；力辰牌C30型玻璃儀器氣流烘干器，邦西儀器科技（上海）有限公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YRE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；101-2BS型熱風(fēng)循環(huán)烘箱，邦西儀器科技（上海）有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵，邦西儀器科技（上海）有限公司。

1.2 試劑

香蒲新苷標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)wkq19111107，四川省維克奇生物科技有限公司；蒲黃粉末，四川湘起之秀中藥材有限公司；甲醇，色譜純，天津歐博凱化工有限公司；乙腈，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水，廣州屈臣氏食品有限公司；95%乙醇，分析純，天津歐博凱化工有限公司；磷酸，分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蒲黃鎮(zhèn)痛提取物

稱取50.18 g蒲黃粉末，置于1 000 mL的圓底燒瓶中。分次加入400 mL的95%乙醇，超聲回流提取3次，合并蒲黃提取液，濃縮烘干得到蒲黃提取物浸膏，重量為14.95 g。

1.3.2 溶液制備

（1）供試品溶液。精密稱定蒲黃浸膏約0.5 g，置50 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解，超聲10 min，放冷，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

（2）對(duì)照品溶液。精密稱取香蒲新苷對(duì)照品適量，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，放冷，定容，搖勻，配制成100 μg/mL的香蒲新苷對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

1.3.3 色譜條件

取“1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別采用HPLC-UVD法測(cè)定。色譜條件：色譜柱Amethyst C18-H（4.6 mm×250 mm，5 μm），流 動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸（15∶85），UVD檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速 1.0 mL/min，柱溫 25 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。色譜圖如圖1所示。

圖1 蒲黃提取物中香蒲新苷的HPLC圖

1.3.4 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系的考察。取“1.3.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，精密吸取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL放置10 mL棕色容量瓶里，用甲醇定容，分別制成 20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL和100 μg/mL一系列梯度濃度的香蒲新苷對(duì)照品溶液。按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，記錄相關(guān)峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸。

（2）穩(wěn)定性考察。取“1.3.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液適量，常溫下放置，并且按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，考察溶液穩(wěn)定性。

（3）精密度考察。取“1.3.2”項(xiàng)下香蒲新苷對(duì)照品溶液適量，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。

（4）重復(fù)性考察。按照“1.3.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，并按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄供試品中色譜峰面積。

（5）加標(biāo)回收率考察。精密量取5 mL的供試品溶液6份置于10 mL的棕色容量瓶中，另精密量取2 mL含100 μg/mL的香蒲新苷對(duì)照品加入棕色容量瓶中，用甲醇定容，搖勻得6份樣品，平行測(cè)定，記錄色譜峰面積。

（6）樣品含量測(cè)定。取3批樣品，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算3批樣品中香蒲新苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

HPLC檢測(cè)蒲黃中香蒲新苷的線性關(guān)系如圖2所示。結(jié)果表明，線性回歸方程為y=11.362x-14.037，R2=0.997 2，香蒲新苷在20～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 香蒲新苷檢測(cè)線性關(guān)系考察

2.2 穩(wěn)定性

香蒲新苷檢測(cè)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。如表2所示，計(jì)算得香蒲新苷峰面積的RSD值為2.27%（n=6），表示供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 香蒲新苷檢測(cè)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 精密度

香蒲新苷檢測(cè)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。如表3所示，計(jì)算得香蒲新苷峰面積的RSD值為2.55%（n=6），表明儀器精密度良好。

表3 香蒲新苷檢測(cè)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性

香蒲新苷檢測(cè)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。如表4所示，計(jì)算得香蒲新苷峰面積的RSD值為0.32%（n=6），表明該方法的重現(xiàn)性較好。

表4 香蒲新苷檢測(cè)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定

3批樣品中香蒲新苷含量檢測(cè)結(jié)果見表5。如表5所示，3批樣品中香蒲新苷的含量為0.63%～0.65%，香蒲新苷平均含量為0.64%。

表5 3批樣品中香蒲新苷含量

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

香蒲新苷檢測(cè)加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6 。如表6所示，香蒲新苷的加樣回收率RSD值為1.16%（n=6），則表明此方法的準(zhǔn)確度較好。

表6 香蒲新苷檢測(cè)加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

香蒲新苷是蒲黃的主成分之一[5]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC法測(cè)定蒲黃提取物中鎮(zhèn)痛成分香蒲新苷的方法學(xué)考察符合要求，穩(wěn)定性高，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，3批次樣品中香蒲新苷的含量為0.64%，此方法為蒲黃鎮(zhèn)痛成分的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。