第二類醫(yī)療器械口腔潰瘍含漱液的生物學(xué)評(píng)價(jià)研究

王鑄輝，吳靜紅，肖本友，李健和

(1.湖南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測(cè)所，湖南 長(zhǎng)沙 410014；2.康多寶醫(yī)療健康產(chǎn)品(湖南)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410010；3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 長(zhǎng)沙 410011)

0 引言

國(guó)外Access Pharmaceuticals,Inc.公司以苯甲醇為主要成分開(kāi)發(fā)上市了口腔潰瘍含漱液，并以第二類醫(yī)療器械在我國(guó)進(jìn)口注冊(cè)上市，注冊(cè)號(hào)為：國(guó)食藥監(jiān)械(進(jìn))字2012第2630299號(hào)，商品名：妙固(MuGard)，組成成分為水、卡波姆均聚物A、甘油、糖精鈉、磷酸、檸檬酸、苯甲醇、氫氧化鉀、聚山梨醇酯60，其中苯甲醇濃度為1.5%，適用于預(yù)防和治療各種口腔黏膜炎、口腔潰瘍(復(fù)發(fā)性口腔潰瘍或手術(shù)、假牙、正畸等引起的創(chuàng)傷性潰瘍)，預(yù)防和治療各種放化療性口炎。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[1-6]報(bào)道的臨床應(yīng)用情況顯示：口腔潰瘍含漱液用于緩解口腔潰瘍及口腔炎癥創(chuàng)面所帶來(lái)的疼痛，安全有效；對(duì)治療頭頸部放療患者口腔黏膜炎有很好的預(yù)防及治療效果。據(jù)此，我們也研制開(kāi)發(fā)了第二類醫(yī)療器械口腔潰瘍含漱液，現(xiàn)將其生物學(xué)評(píng)價(jià)研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

AE200電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；Thermo 311 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；BSC-100IIA2生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；XDS-1倒置顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)；WMK-02隔水式恒溫培養(yǎng)箱(山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司)；Plus 384酶標(biāo)儀(美國(guó) Molecular Devices公司)。

1.2 試藥

口腔潰瘍含漱口液(康多寶醫(yī)療健康產(chǎn)品(湖南)有限公司，批號(hào)：20190111)；MTT溶液(北京索萊寶科技有限公司)；DMSO溶液(CALBIOCHEM公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)；氯化鈉注射液(湖南科倫制藥有限公司)；弗氏完全佐劑(CFA)(SIGMA公司)；植物油(山東魯花集團(tuán)有限公司)。

1.3 動(dòng)物

普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔，體重2.0-2.5kg，武漢市萬(wàn)千佳興生物科技有限公司提供；白色豚鼠，體重350-500g，武漢市萬(wàn)千佳興生物科技有限公司提供；ICR小白鼠，SPF級(jí)，體重18-22g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

(1)試驗(yàn)方法[7]

細(xì)胞培養(yǎng)液的制備：使用前將分裝好的胎牛血清50mL加入1640培養(yǎng)基至500mL，混勻。

供試液的制備：取無(wú)菌樣品3.08g，按1:40比例加入123.2mL含血清細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃±1℃條件下放置24h制備浸提液。

陰性對(duì)照液：高密度聚乙烯浸提液。

陽(yáng)性對(duì)照液：5%DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。

細(xì)胞混懸液的制備：取正常培養(yǎng)的L-929細(xì)胞，消化吹打計(jì)數(shù)，平均為183×104個(gè)/mL。將0.3mL細(xì)胞混懸液加入培養(yǎng)液中至54.9mL，稀釋至183倍，濃度為1×104個(gè)/mL。吸100μL細(xì)胞混懸液注入培養(yǎng)板內(nèi)。放入含5%的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄去原培養(yǎng)液，每孔分別加入100μL的空白對(duì)照液、陰性對(duì)照液、陽(yáng)性對(duì)照液、試驗(yàn)樣品浸提液，每組設(shè)8孔。分別于72h后棄去孔內(nèi)的液體，每孔加入20μL濃度為5g/L的MTT溶液，在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。棄去孔內(nèi)的液體，每孔分別加入150μL DMSO溶液，10min后振蕩，在酶標(biāo)儀上用雙波長(zhǎng)(570nm和630nm)法測(cè)定吸光度。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖度(relative growth rate，RGR)，RGR=供試品(陰性、陽(yáng)性組)吸光度/空白對(duì)照組吸光度×100%，并判斷細(xì)胞毒性級(jí)別。RGR分級(jí)如下：分級(jí)為0、1、2、3、4，對(duì)應(yīng)的相對(duì)增殖度為≥100、80-90、50-79、30-49、0-29。

(2)結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，試驗(yàn)組相對(duì)增殖度為0級(jí)或1級(jí)為合格；試驗(yàn)組相對(duì)增殖度為2級(jí)，應(yīng)結(jié)合形態(tài)綜合評(píng)價(jià)，輕微毒或無(wú)毒的為合格；試驗(yàn)組相對(duì)增殖度為3級(jí)-4級(jí)為不合格。由表1可知，供試品的細(xì)胞毒性為1級(jí)，為合格。

表1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)

(1)試驗(yàn)方法[8]

供試液制備：取口腔潰瘍含漱液4.08g，放入一玻璃器皿中，加入0.9%氯化鈉注射液20.4mL，封閉后置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃浸提1h，即得供試品浸提液。

空白對(duì)照液：0.9%氯化鈉注射液。

取試驗(yàn)兔雌雄各1只，體重2.0-2.5kg，要求無(wú)任何皮膚病或損傷，未做過(guò)任何試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前24h在兔脊柱兩側(cè)各剪剃5cm×15cm區(qū)域兔毛，避免損傷皮膚。試驗(yàn)時(shí)用75%乙醇清潔暴露皮膚，在每只兔脊柱一側(cè)的10個(gè)點(diǎn)，皮內(nèi)注射0.2mL供試品浸提液，在每只兔脊柱一側(cè)的5個(gè)點(diǎn)，皮內(nèi)注射0.2mL空白對(duì)照液，注射后24h、48h和72h，觀察注射局部及其皮膚組織反應(yīng)，包括紅斑、水腫和壞死等，進(jìn)行皮膚刺激性評(píng)分，見(jiàn)表2，計(jì)算原發(fā)性記分與原發(fā)性刺激指數(shù)(PII)。供試品浸提液記分減去空白對(duì)照液記分為每只兔的原發(fā)性刺激記分，每只兔原發(fā)性刺激記分相加再除以兔總數(shù)為原發(fā)性刺激指數(shù)(PII)，按原發(fā)性刺激指數(shù)(PII)：0.0-0.4、0.5-1.9、2.0-4.9、5.0-8.0劃分相應(yīng)反應(yīng)等級(jí)：無(wú)、輕度、中度、重度。

表2 皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

(2)結(jié)果

口腔潰瘍含漱液注射于試驗(yàn)兔后24h、48h、72h，供試品浸提液記分均為0分、空白對(duì)照液記分均為0分、原發(fā)性刺激記分均為0分、原發(fā)性刺激指數(shù)均為0分，肉眼觀察試驗(yàn)兔均未見(jiàn)紅斑、水腫及壞死現(xiàn)象，口腔潰瘍含漱液對(duì)動(dòng)物機(jī)體無(wú)皮內(nèi)刺激反應(yīng)。

2.3 皮膚致敏性試驗(yàn)

(1)試驗(yàn)方法[9]

供試液制備：取口腔潰瘍含漱液4.0g，放入一玻璃器皿中，加入0.9%氯化鈉注射液20mL，置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃滅菌60min，即得供試品浸提液。將供試品浸提液、陰性對(duì)照液、5%甲醛陽(yáng)性對(duì)照液與弗氏完全佐劑(CFA)等體積混合，用力攪拌數(shù)分鐘至完全乳化為止。

將白色豚鼠30只隨機(jī)分為3組，每組雌雄各半，試驗(yàn)前24h剃除豚鼠肩胛骨內(nèi)側(cè)部位4cm×6cm區(qū)域毛發(fā)。試驗(yàn)時(shí)用75%乙醇清潔豚鼠背部去毛區(qū)，在每只豚鼠去毛區(qū)做6點(diǎn)對(duì)稱的皮內(nèi)注射?？款^部2點(diǎn)部位A：注射弗氏完全佐劑與選定的溶劑等體積混合的穩(wěn)定性乳化劑。中間2點(diǎn)部位B：注射未經(jīng)稀釋的浸提液試驗(yàn)樣品；對(duì)照組僅注射相應(yīng)溶劑?？课膊?點(diǎn)部位C：試驗(yàn)樣品與弗氏完全佐劑和溶劑等體積混合的穩(wěn)定性乳化劑。各點(diǎn)相距1-2cm，每點(diǎn)注射量為0.1mL。皮內(nèi)注射后7d，在注射部位再次剃毛，用75%乙醇清潔。若未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，每一試驗(yàn)區(qū)用10%十二烷基硫酸鈉石蠟液預(yù)處理，在局部斑貼前24h涂抹、按摩試驗(yàn)區(qū)皮膚。24h后將2cm×4cm濾紙浸入供試品浸提液(部位B采用的濃度)或陰性對(duì)照液、陽(yáng)性對(duì)照液至飽和，將其貼敷于豚鼠背部注射部位，封閉固定48h。

于誘導(dǎo)完成14d，在豚鼠上腹側(cè)未實(shí)驗(yàn)部位剃毛，用75%乙醇清潔，將2cm×2cm濾紙浸入供試品浸提液(按部位C選定的濃度)或陰性對(duì)照液、陽(yáng)性對(duì)照液至飽和，將其貼敷于剃毛區(qū)，封閉固定24h。將貼敷物取下后24h和48h，分別觀察豚鼠激發(fā)部位皮膚情況，按如下給出的Magnusson和Kligman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每一激發(fā)部位和每一觀察時(shí)間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行分級(jí)，敷貼試驗(yàn)反應(yīng)：無(wú)明顯改變、散發(fā)性或斑點(diǎn)狀紅斑、中度融合性紅斑、重度紅斑和水腫，其相對(duì)應(yīng)的等級(jí)分別為：0、1、2、3級(jí)。

2 結(jié)果

試驗(yàn)期間豚鼠無(wú)任何異常表現(xiàn)，沒(méi)有中毒癥狀，也沒(méi)有豚鼠死亡。陰性對(duì)照組和供試品組激發(fā)后1h、24h、48h均未出現(xiàn)紅斑和水腫，致敏試驗(yàn)為陰性。而對(duì)照組激發(fā)后1h、24h、48h均出現(xiàn)中度、重度紅斑和水腫，致敏試驗(yàn)為陽(yáng)性。在本試驗(yàn)條件下，口腔潰瘍含漱液對(duì)動(dòng)物機(jī)體無(wú)致敏反應(yīng)。

2.4 急性全身毒性試驗(yàn)

(1)試驗(yàn)方法[10]

供試液制備：取口腔潰瘍含漱液4.0g兩份置浸提器內(nèi)，其中一份加入0.9%氯化鈉注射液20mL，另一份加入植物油20mL，置37℃±1℃恒溫箱中，于24h內(nèi)使用。同法制備介質(zhì)對(duì)照液。

取雌雄各半小白鼠10只，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，經(jīng)尾靜脈分別注射氯化鈉浸提液和介質(zhì)對(duì)照液，注射量：0.5mL/10g，注射速度：0.1mL/s。另取10只由腹腔分別注入植物油浸提液和介質(zhì)對(duì)照液，注射量：0.5mL/10g。注射完畢后，觀察小白鼠即時(shí)反應(yīng)，并于4h、24h、48h、72h觀察和記錄試驗(yàn)組和對(duì)照組的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)。注射后動(dòng)物反應(yīng)觀察指標(biāo)見(jiàn)表3。

表3 注射后動(dòng)物反應(yīng)觀察指標(biāo)

(2)結(jié)果

試驗(yàn)組和對(duì)照組的氯化鈉浸提液、試驗(yàn)組和對(duì)照組的植物油浸提液分別注射于小白鼠體內(nèi)，即時(shí)反應(yīng)、4h、24h、48h、72h觀察都無(wú)毒性癥狀，體重也并未下降。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，在72h觀察期內(nèi)，試驗(yàn)組動(dòng)物的反應(yīng)不大于對(duì)照組動(dòng)物，則判斷供試品合格。因此，口腔潰瘍含漱液無(wú)急性全身毒性反應(yīng)。

3 討論

生物學(xué)評(píng)價(jià)研究在于預(yù)測(cè)產(chǎn)品使用過(guò)程中對(duì)機(jī)體帶來(lái)的潛在危害性，試圖提供安全信息，將不安全的風(fēng)險(xiǎn)減少到最低程度。對(duì)口腔潰瘍含漱液的生物學(xué)評(píng)價(jià)研究包括細(xì)胞毒性試驗(yàn)、皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)、皮膚致敏試驗(yàn)以及急性全身毒性試驗(yàn)，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量和臨床使用的安全性。

本課題成功制備了口腔潰瘍含漱液，其配方合理，制備工藝簡(jiǎn)單可行，質(zhì)量可控，穩(wěn)定性、安全性良好，抑菌作用顯著，本品的研制成功將對(duì)多種口腔致病菌和非致病菌有抑制和殺滅作用。本品用于緩解口腔潰瘍及口腔炎癥創(chuàng)面所帶來(lái)的疼痛，安全有效；對(duì)治療各種口腔黏膜炎、口腔潰瘍(復(fù)發(fā)性口腔潰瘍或手術(shù)、假牙、正畸等引起的創(chuàng)傷性潰瘍)、各種放化療性口炎有很好的預(yù)防及治療效果。