大柴胡湯改善肝胃郁熱型T2DM及胰島β細(xì)胞功能 損害的研究

岑曦，張靜，王艷

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

0 引言

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，2型糖尿病(T2DM)即非胰島素依賴(lài)性糖尿病，在其發(fā)展的早期階段，胰島β細(xì)胞功能低下，開(kāi)始出現(xiàn)胰島素分泌功能減退，“三多一少”的癥狀明顯，但無(wú)明顯心、腎、腦損傷[1]。T2DM 的誘發(fā)機(jī)制復(fù)雜，目前一般認(rèn)為，T2DM 的病理生理機(jī)制主要包括β細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗(IR) 兩個(gè)方面[2]，胰島β細(xì)胞數(shù)量的逐步減少和功能的損害是早期T2DM發(fā)生的重要標(biāo)志[3]。目前，已證實(shí)糖毒性、脂毒性、炎癥、胰島淀粉樣多肽過(guò)多沉積、氧化應(yīng)激均會(huì)對(duì)胰島β細(xì)胞造成損害，會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的功能?chē)?yán)重障礙[4-6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，大柴胡湯在調(diào)節(jié)胰島素分泌、參與葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過(guò)程中起到重要作用，且在胰島素抵抗通路上富集的靶點(diǎn)最多[7]。嚴(yán)學(xué)森[8]認(rèn)為具有內(nèi)泄熱結(jié)，和解少陽(yáng)功效的大柴胡湯治療消渴，可滌蕩郁滯，通利氣機(jī)；王國(guó)斌[9]認(rèn)為由于飲食、情志等因素導(dǎo)致的肝失疏泄在消渴中占重要地位。仝小林[10]認(rèn)為消渴分為“郁、熱、虛、損”四大階段，在郁熱階段，胃納太過(guò)、脾運(yùn)不及、肝木郁結(jié)，且熱象逐漸明顯。故研究大柴胡湯對(duì)早期肝胃郁熱型T2DM的治療效果為對(duì)象，采用SD大鼠，通過(guò)觀察一般情況、FBG、FINS、血清C肽、HOMAIR、HOMA-β、血脂六項(xiàng)的變化，從而證明大柴胡湯具有增加胰島β細(xì)胞數(shù)量、改善胰島β細(xì)胞和IR的作用，對(duì)于T2DM早期治療、延緩和防止進(jìn)階病變有重要的意義。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康CV級(jí)雄性SD大鼠60只，體重(200±20)g，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0001。室溫20℃～25℃，濕度50%～65%，每日光照正常，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.2 藥物

大柴胡湯：《金匱要略》中，柴胡半斤，黃芩三兩，芍藥三兩，半夏半升(洗)，生姜五兩(切)，枳實(shí)四枚(炙)，大棗12枚(擘)，大黃二兩。根據(jù)國(guó)家劑量總局編《中國(guó)古代度量衡圖集》記載漢代一兩為15.6g，又據(jù)人(60kg)和動(dòng)物(200±20)g間按體表面積折算的等效劑量比值表?yè)Q算得出：柴胡26.8g，黃芩10g，大黃6.8g，枳實(shí)4.5g，白芍10g，法半夏8.3g，大棗5.2g，生姜16.8g。藥物購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，煎煮濃縮至1g/mL；鹽酸二甲雙胍腸溶片(貴州天安藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.25g/片，國(guó)藥準(zhǔn)字：20160646)。

1.3 主要試劑及儀器

高脂高糖飼料、普通大小鼠維持飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0010)；鏈脲佐菌素(STZ)(北京索來(lái)寶生物科技有限公司)；胰島素測(cè)定試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20170805)；大鼠C肽ELISA試劑盒(產(chǎn)品貨號(hào)：MM-0588R1)；總膽固醇試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：YZB/國(guó) 2084-2003)；甘油三酯試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：YZB/國(guó) 2087-2003)；直接低密度脂蛋白膽固醇試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：YZB/國(guó) 0599-2003)；直接高密度脂蛋白膽固醇試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：YZB/國(guó) 0677-2003)；游離脂肪酸微量測(cè)定試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20170701)；安穩(wěn)血糖儀配套血糖試紙(三諾生物傳感股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：2629EN)；A6半自動(dòng)生化儀(北京松上技術(shù)有限公司)；華衛(wèi)德朗DR-200BS酶標(biāo)分析儀(無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)。

1.4 動(dòng)物分組及處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白組(10只)和造模組(50只)，空白組常規(guī)飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，進(jìn)行合籠飼養(yǎng)(同組的2籠大鼠合于1籠，每次持續(xù)12h)、禁食(不禁水，每次持續(xù)12h)、禁水(不禁食，每次持續(xù)12h)，以上三項(xiàng)每天隨機(jī)安排一種[11]，持續(xù)4周后，大鼠禁食不禁水12h，稱(chēng)重，造模組大鼠分三次腹腔內(nèi)注射 STZ(20mg /kg，溶于0.1mmol /L 檸檬酸緩沖液，pH 4.5，終濃度為1%，冰浴，現(xiàn)配現(xiàn)用，20min內(nèi)用完)，空白組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液。72h后，造模組大鼠出現(xiàn)情緒暴躁的表現(xiàn)，毛發(fā)豎起，多飲、多食、多尿癥狀，進(jìn)行尾靜脈采血，血糖≥16.7mmol /L，則肝胃郁熱型T2DM 模型成功[12]。

造模過(guò)程中，空白組死亡1只，剩余9只。造模組死亡18只，剩余32只。造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組(n=7)、西藥組(n=7)、HCM組(n=6)、MCM組(n=6)、LCM組(n=6)。空白組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余各組給予高糖高脂飼料以維持。西藥組給予二甲雙胍1.5g·kg-1灌胃，HCM、MCM、LCM組分別給予大柴胡湯水煎液3.38g·kg-1，1.13g·kg-1，0.38g·kg-1灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，各組大鼠均自由飲水，共灌胃4周。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

樣本制備給藥4周后，大鼠禁食不禁水12～14h后檢測(cè)空腹血糖(FBG)并稱(chēng)重，以水合氯醛(30mg/kg)腹腔麻醉，大鼠仰臥位固定，局部消毒后沿腹正中線打開(kāi)腹腔，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血10mL，12000r/分離心10min，分離血清，置-20℃冰箱保存；分離胰腺周?chē)静⑷〕鲆认?，將胰腺?biāo)本置于4%中性甲醛固定液，用于HE染色觀察病理形態(tài)。

一般情況觀察大鼠精神狀態(tài)、飲食及活動(dòng)情況、毛色、飲水量、尿量等；并分別于給藥前后提大鼠尾部促使其排空尿液測(cè)量體重。

空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)及血清C肽檢測(cè)采用安穩(wěn)血糖儀檢測(cè)，簡(jiǎn)述方法(取血位置、方法等)。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)FINS、血清C肽：取出4℃放置的試劑盒于室溫0.5h，取濃縮洗滌液，根據(jù)當(dāng)批檢測(cè)數(shù)量，用蒸餾水1∶20稀釋?zhuān)靹蚝髠溆茫恍?zhǔn)品S1～S5及質(zhì)控品，第一次使用前先用0.5mL蒸餾水溶解后充分搖勻，放置10min后使用；將預(yù)包被板從密封袋中取出，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔，不加入任何液體，每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)一次各設(shè)兩孔，每孔加入相應(yīng)校準(zhǔn)品50 μL，其余每個(gè)檢測(cè)孔直接加質(zhì)控品或帶測(cè)血清50μL，然后各孔加入酶標(biāo)抗體50μL，充分混勻，貼上封板膜，置37℃溫育1h；棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿(mǎn)各孔，靜置10s甩干，重復(fù)3次后拍干；每孔加顯色劑A液50μL，顯色劑B液50μL，振蕩混勻后，置37℃避光顯色15min，每孔加終止液50μL；在15min內(nèi)在450nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度A；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本濃度。胰島素抵抗指數(shù)及分泌指數(shù)的計(jì)算：根據(jù)FBG和FINS計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島素分泌指數(shù)(HOMA-β)。計(jì)算公式：HOMA-IR= FBG×FINS/22.5；HOMA-β= 20×FINS/(FBG-3.5)。

半自動(dòng)生化儀取XX微升樣本，使用比色法檢測(cè)總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，糖化血紅蛋白(HbA1c)，游離脂肪酸(FFA)，直接低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，直接高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，數(shù)據(jù)以XX表示。

HE染色將固定液中的胰腺組織進(jìn)行酒精脫水及二甲苯透明；用石蠟進(jìn)行浸蠟，包埋后切片，展片，烤片；使用二甲苯脫蠟，酒精至水；再使用蘇木精水溶液，酒精伊紅染色液染色；脫水、透明后封片。進(jìn)行鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD方法，以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG水平和體重比較

與空白組相比，模型組體重下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，西藥組FBG下降、體重顯著降低，LCM、MCM組體重減輕，HCM組體重顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與西藥組相比，LCM組FBG下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠FBG水平、體重比較(±s)

表1 各組大鼠FBG水平、體重比較(±s)

注：FBG，空腹血糖；與空白組比較，*P<0. 05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01；與西藥組比較，▲P<0.05(下同)。

組別 例數(shù) FBG(mmol/L) 體重(g)空白組 9 4.85±0.59 295.5±11,24模型組 7 19.18±1.24 272.9±13.5**西藥組 7 7.95±2.90△ 214.9±23.4△△LCM組 6 6.83±2.97▲ 246.2±23.4△▲MCM組 6 6.48±2.89 245±17.2△▲HCM組 6 10.02±1.02▲ 232.3±28.8△△

2.2 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-β、C肽水平比較

與空白組相比，模型組FINS下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HOMA-β和C肽顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，MCM、HCM組FINS升高，MCM組HOMA-IR顯著降低，HCM組HOMA-β顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各治療組C肽變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與西藥組相比，MCM組FINS升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-β、C肽水平比較(±s)

表2 各組大鼠FINS、HOMA-IR、HOMA-β、C肽水平比較(±s)

注：C-Peptide，c肽；FINS，空腹胰島素；HOMA-IR，胰島素抵抗指數(shù)；HOMA-β，胰島素分泌指數(shù)。

組別 例數(shù) FINS(mIU/L) HOMA-IR HOMA-β Peptide(ng/mL)空白組 9 14.03±3.02 3.08±1.06 209.56±35.67 0.13±0.00模型組 7 6.15±1.21* 5.28±1.35 7.8±1.07** 0.13±0.00西藥組 7 6.41±1.35 2.28±0.97△ 66.83±56.8 0.13±0.00 LCM組 6 2.8±3.54 1.17±1.82 18.26±11.43 0.13±0.00 MCM組 6 8.11±0.7△▲ 2.38±1.17△△ 124.97±110.44 0.13±0.00 HCM組 6 11.41±3.43△ 5.15±1.85▲ 34.81±7.85△△ 0.13±0.00

2.3 各 組 大 鼠HDL-C、LDL-C、TC、TG、FFA、HbA1c水平比較

與模型組相比，西藥組TC顯著降低、TG降低，與西藥組相比，LCM組TG降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組HDL-C、LDL-C、FFA與HbAlc比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠HDL-C、LDL-C、TC、TG、FFA、HbA1c水平比較(±s)

表3 各組大鼠HDL-C、LDL-C、TC、TG、FFA、HbA1c水平比較(±s)

注：HDL-C，直接高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C，直接低密度脂蛋白膽固醇；TC，血清總膽固醇；TG，甘油三酯；FFA，游離脂肪酸；HbA1c，糖化血紅蛋白。

組別 例數(shù) HDL-C LDL-C TC TG FFA HbA1c空白組 9 0.43±0.38 0.81±0.07 6.68±2.7 2.78±1.71 0.7±0.15 9.2±1模型組 7 0.74±0.26 2.43±1.79 6.87±1.75▲ 2.74±0.59▲ 0.51±0.03 6.7±0.29西藥組 7 0.62±0.48 0.76±0.22 6.76±2.28△△ 2.52±1.6△ 0.57±0.10 8.31±0.46 LCM組 6 0.5±0.36 0.74±0.07 6.71±2.7 2.85±1.2▲ 0.46±0.07 7.8±0.55 MCM組 6 0.7±0.12 0.89±0.03 4.24±1.03 1.67±0.3 0.33±0.08 5.2±0.29 HCM組 6 0.95±0.27 1.22±0.28 4.71±1.59 2.1±0.47 0.39±0.03 6.34±0.4

2.4 各組大鼠HE染色胰腺病理形態(tài)比較

空白組有大量正常胰島分布，胰腺小葉組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡小葉完整，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組僅見(jiàn)少量殘存的纖維化胰島，胰腺小葉輪廓破壞，大面積出血壞死，間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。西藥組胰腺組織內(nèi)胰島赫外分泌腺中只有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，散在新生胰島，胰島數(shù)目較模型組有所增加，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。中藥組較模型組病變有明顯改善，MCM組最為明顯，除可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)外，未見(jiàn)其他明顯病理改變，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠HE染色病理形態(tài)比較 40×10

3 討論

T2DM的發(fā)病機(jī)制主要為胰島素抵抗(IR)及β細(xì)胞功能受損，這兩方面也可用來(lái)預(yù)測(cè)肥胖及糖耐量不足的病人患T2DM的高風(fēng)險(xiǎn)，且在兒童和青少年群體中，T2DM發(fā)病率持續(xù)上升[13]。由此，從糖尿病發(fā)病前期以及糖尿病家系的非糖尿病一級(jí)親屬等高危人群，到糖尿病進(jìn)展過(guò)程中，β細(xì)胞功能受損普遍存在。普遍觀點(diǎn)認(rèn)為，在T2DM發(fā)展過(guò)程中，隨著IR的持續(xù)存在，β細(xì)胞功能會(huì)發(fā)生進(jìn)行性喪失，反過(guò)來(lái)也會(huì)導(dǎo)致IR加重，而近幾年研究發(fā)現(xiàn)，胰島素過(guò)度分泌可能先于IR發(fā)生，胰島素分泌時(shí)間會(huì)提前并且延長(zhǎng)，促進(jìn)IR[14]，故盡早干預(yù)以保護(hù)β細(xì)胞功能、改善IR成為治療T2DM的關(guān)鍵。目前研究T2DM的方式是將基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)相互聯(lián)合，動(dòng)態(tài)地，多角度地，整體地分析其病理變化[15-17]，而中醫(yī)治療的特點(diǎn)與上述研究方式契合：中藥由許多復(fù)合成分組成，作用的機(jī)理往往是多途徑、多因素、多環(huán)節(jié)的[18]；同時(shí)，需通過(guò)降糖、降脂、糾正代謝紊亂等綜合因素來(lái)改善IR及β細(xì)胞功能障礙的治療指導(dǎo)原則也符合中醫(yī)整體觀診療思維。

消渴病早期的演變?cè)凇端貑?wèn)·奇病論》中提及：“此五氣之溢也，名曰脾癉。夫五味入口，藏于胃，脾為之行其精氣，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所發(fā)也，此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿(mǎn)，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴，治之以蘭，除陳氣也?！贝藭r(shí)胃納太過(guò)，脾運(yùn)不及，適用于大柴胡湯滌蕩郁滯，通利氣機(jī)；同時(shí)，《靈樞·五變篇》最早認(rèn)識(shí)到肝與消渴病的聯(lián)系：“怒則氣上逆，胸中畜積，血?dú)饽媪簟D(zhuǎn)而為熱，熱則消肌膚，故為消癉”因此，在消渴病早期，過(guò)食肥甘、中滿(mǎn)內(nèi)熱、情志不暢導(dǎo)致的脾胃氣機(jī)失調(diào)、肝氣郁滯是其主要病機(jī)，符合肝胃郁熱型T2DM的特征。仝小林[19]認(rèn)為，肝胃郁熱是T2DM郁熱階段的主要病機(jī)，取大柴胡湯和解少陽(yáng)、內(nèi)瀉熱結(jié)的功效，用開(kāi)郁清熱法治療肝胃郁熱型T2DM早期，療效肯定，降糖效果明顯。就目前治療現(xiàn)狀來(lái)看，中醫(yī)藥在治療DM方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，故研究古方的廣泛應(yīng)用及其作用機(jī)制具有重要意義。

大柴胡湯源于《傷寒論》和《金匱要略》，據(jù)考察，漢代一兩折合15.6g是符合度量衡沿革史實(shí)及科學(xué)考證的，較貼近仲景劑量原貌[20]，故大柴胡湯的經(jīng)方劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超于現(xiàn)代臨床用量。此方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，方中重用柴胡為君藥，配臣藥黃芩和解清熱，以除少陽(yáng)之邪；輕用大黃配枳實(shí)以?xún)?nèi)瀉陽(yáng)明熱結(jié)，行氣消痞，亦為臣藥。芍藥柔肝緩急止痛，與大黃相配可治腹中實(shí)痛，與枳實(shí)相伍可以理氣和血，以除心下滿(mǎn)痛；半夏和胃降逆，配伍大量生姜，以治嘔逆不止，共為佐藥。大棗與生姜相配，能和營(yíng)衛(wèi)而行津液，并調(diào)和脾胃，功兼佐使?？傊?，本方既不悖于少陽(yáng)禁下的原則，又可和解少陽(yáng)，內(nèi)瀉熱結(jié)，使少陽(yáng)與陽(yáng)明合病得以雙解，可謂一舉兩得。然而大柴胡湯作為經(jīng)方，本應(yīng)藥少而精，藥專(zhuān)力宏，臨床用方卻藥味繁多，劑量偏小，與經(jīng)方治療危、難、重證的效果相差甚遠(yuǎn)。本篇論點(diǎn)為早期T2DM是由于郁熱內(nèi)結(jié)，應(yīng)從肝胃論治，主要在肝[21]。此經(jīng)方中各藥物嚴(yán)密配伍，各司其職，缺一不可，加味有余，共奏解少陽(yáng)泄陽(yáng)明之效，而經(jīng)方用于臨床，必須注重回歸原方劑量，才能提高臨床療效，對(duì)于T2DM早期治療、延緩和防止進(jìn)階病變有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：①大柴胡湯可降低糖尿病初期大鼠的體重和FBG，改善肝胃郁熱癥狀，減慢“三多一少”癥狀出現(xiàn)的速度；HOMA-IR水平降低，則說(shuō)明該方改善IR有效；FINS、HOMA-β升高，胰島細(xì)胞數(shù)目增加，說(shuō)明該方可恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能。綜上，大柴胡湯可減緩早期糖尿病的進(jìn)行性發(fā)展。②中藥中劑量組，也就是大柴胡湯原方改善各項(xiàng)指標(biāo)的作用較為明顯，從而證明古方治療肝胃郁熱型T2DM及改善胰島β細(xì)胞功能具有重要的意義，值得開(kāi)展進(jìn)一步的機(jī)制研究。存在問(wèn)題：血脂六項(xiàng)以及血清C肽的變化不顯著，可能是由于大柴胡湯降血脂需要一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，C肽的水平也需要長(zhǎng)期的疾病過(guò)程來(lái)體現(xiàn)顯著的差異，短期的造模時(shí)間未能完全體現(xiàn)。創(chuàng)新性：突出現(xiàn)代臨床用藥劑量與經(jīng)方劑量的差別所在，強(qiáng)調(diào)回歸原始經(jīng)方劑量，將其用于實(shí)驗(yàn)、指導(dǎo)臨床，從而切實(shí)提高療效的重要性，值得進(jìn)一步探討。