磁性納米氣泡的超聲和磁共振雙模態(tài)造影

李斌，楊芳

(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210009)

0 引言

超聲診斷技術(shù)由于具有安全、低成本且能實(shí)時(shí)等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用。但是醫(yī)用低頻超聲分辨率有限，不能很好地將肌肉組織和血管區(qū)分開,且難以觀察到微血管[1]。磁共振診斷技術(shù)分辨率高，但對(duì)于血管的敏感性低[2]。所以超聲和磁共振檢測(cè)微血管時(shí)都需要使用造影劑來(lái)提高超聲成像分辨率[3]。目前使用的超聲造影劑通常是直徑在10微米以下的氣泡，利用微氣泡對(duì)超聲波的非線性效應(yīng)實(shí)現(xiàn)與周圍機(jī)體組織的區(qū)分，提供組織灌注成像方法[4]。而核磁造影劑主要使用的是小分子釓類螯合物和超順磁性納米顆粒。釓類磁共振造影劑用藥劑量大，機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)高，而磁性納米顆粒比釓類造影劑毒性更小，所以目前使用磁性納米顆粒做造影劑有較好的前景[2,5,6]。

目前迫切需要研發(fā)一種在超聲和核磁共振都能有優(yōu)良造影效果的造影劑，且最好避免使用毒副作用大的材料。而磷脂類材料有較好的生物相容性，且有其兩親性結(jié)構(gòu)(一端為親水性頭部和一端的疏水性尾部)，導(dǎo)致其可以在水相中進(jìn)行自組裝形成脂質(zhì)體和磷脂氣泡等結(jié)構(gòu)[7,8]。與此同時(shí)形成的組裝體內(nèi)部可以裝載顆粒(如脂質(zhì)體內(nèi)部可以裝載藥物)，或者膜殼表面進(jìn)行其他顆粒的裝載[9,10]。

本文使用磷脂材料制備成脂質(zhì)納米氣泡，且進(jìn)一步將磁性納米顆粒裝載到脂質(zhì)膜殼上形成磁性納米氣泡，最終用以實(shí)現(xiàn)良好的超聲核磁雙模態(tài)造影效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料

見表1。

表1 -1 實(shí)驗(yàn)材料

2 磁性納米氣泡的制備與表征

2.1 磁性納米氣泡的制備

將二硬脂酰基磷脂酰膽堿(DSPC)，二棕櫚酰磷脂膽堿(DPPC)，1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[(羧基(聚乙二醇)2000](DSPE-mPEG2000)，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-amine)儲(chǔ)備液按9∶1∶1∶1的摩爾比例進(jìn)行混合，每100mL上述混合物中加3mL甘油作為氣泡保護(hù)劑，取2mL混合溶液至體積為5mL的西林瓶中，再加入20-40μL濃度為2mg/mL的肉桂酸修飾的γ-Fe3O4磁性納米顆粒(MNPs)、2μL濃度為5mg/mL的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，在25℃下反應(yīng)6h。密封后，將瓶中氣體替換為SF6。水浴加熱到60℃，5min后，插入注射器，通過(guò)反復(fù)擠壓注射器的方式制備磁性納米氣泡(MNBs)。擠壓完成后，放置在4℃環(huán)境中保存(MNBs結(jié)構(gòu)如圖1所示)。

圖1 MNBs的結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 磁性納米氣泡的形貌表征

將MNBs稀釋5倍后，取20μL滴加在硅片上自然干燥后使用掃描電鏡(Ultra Plus S4800，Carl Zeiss，德國(guó))對(duì)其進(jìn)行形貌表征；取20μL滴加在銅網(wǎng)上自然干燥后使用透射電鏡(JEM-2100，JEOL，日本)對(duì)其進(jìn)行形貌表征；取20μL滴加在載玻片上并使用光學(xué)顯微鏡(Ti2-U，Nikon，日本)觀察MNBs的膜殼形貌和其表面是否包覆MNPs。

2.3 磁性納米氣泡的粒徑、濃度的表征

粒度電位分析儀(Zetasizer Nano ZS90，Malvern，英國(guó))可以測(cè)量納米顆粒的粒徑和Zeta電位。由于納米顆粒表面帶有電荷會(huì)形成如同膠體表面的電荷水電層，因此，納米顆粒表面會(huì)出現(xiàn)與顆粒表面電荷相反的緊密吸附層，在其外層會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)散層，擴(kuò)散層中兩種電荷的離子都存在，但是兩種離子的量會(huì)有不同，與納米顆粒表面同電性的離子數(shù)量會(huì)較多，因而該層中的總體電性會(huì)與納米顆粒表面的電性相同，所以Zeta電位是測(cè)量納米顆粒擴(kuò)散層中的電位(如圖2)。

圖2 Zeta電位的測(cè)量示意圖

使用粒度電位分析儀測(cè)量MNBs的粒徑，取50μL的MNBs加入粒徑皿中再加入950μL超純水稀釋到1mL，測(cè)量3次取平均(參數(shù)選擇為：溶液選擇water，材料選擇lipid，溫度25℃，預(yù)熱120s，循環(huán)次數(shù)為15次)。再取800μL原液加入電位皿中測(cè)量電位(參數(shù)選擇為：選擇溶液選擇water，材料選擇lipid，溫度選擇25℃，預(yù)熱時(shí)間選擇120s，循環(huán)15次)。

貝克曼庫(kù)爾特粒徑儀(Multisizer4e粒徑分析儀，Beckman Coulter，美國(guó))是通過(guò)納米顆粒通過(guò)小孔時(shí)引起的孔兩端電極的電導(dǎo)率變化來(lái)測(cè)量納米顆粒的濃度和粒徑的大小，測(cè)量時(shí)測(cè)量杯中的部分待測(cè)液體吸入小孔內(nèi)部，由于顆粒通過(guò)小孔時(shí)是單個(gè)通過(guò)，所以可以通過(guò)電流的每一次變化記錄下通過(guò)小孔的顆粒數(shù)，將此顆粒數(shù)除以吸入的待測(cè)液體的體積即為該顆粒的濃度值。并且由于不同大小的顆粒通過(guò)小孔時(shí)引起的電導(dǎo)率變化不同，所以也可以得出不同粒徑顆粒的分布情況。

使用貝克曼庫(kù)爾特粒徑儀測(cè)量磁性顆粒的濃度，選用20μm的小孔管測(cè)量磁性納米顆粒的粒徑，樣品加入量為20μL。

圖5 MNBs的粒徑電位和濃度表征

圖6 MNBs的不同比例稀釋后的超聲造影圖像結(jié)果

2.4 磁性納米氣泡的超聲造影

2.4.1 磁性納米氣泡的對(duì)比超聲濃度探索

制作超聲體膜：膜瓊脂、甘油和超純水按3:4:90的質(zhì)量比例稱量，在2L的燒杯中加熱至90℃以上，連續(xù)使用玻璃棒緩慢攪拌混勻30min以上，至溶液變得透明無(wú)結(jié)塊或無(wú)團(tuán)聚出現(xiàn)，將液體倒入容器中并在其中固定好1.5mL離心管作為樣品孔，冷卻過(guò)夜后倒出整塊體膜。

使用超聲設(shè)備(Vevo2100小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)，Visual Sonics，加拿大)對(duì)普通磷脂氣泡和磁性納米氣泡進(jìn)行體外超聲影像表征，超聲參數(shù)為18MHz，25dB，30% power。先對(duì)磁性納米氣泡進(jìn)行不同比例的稀釋，以尋找合適的超聲造影濃度(按照8倍，16倍，32倍，64倍，128倍和256倍的比例對(duì)磁性納米氣泡進(jìn)行稀釋)，對(duì)不同稀釋比例的磁性納米氣泡進(jìn)行超聲對(duì)比造影(Contrastmode)。

2.4.2 磁性納米氣泡的超聲信號(hào)的時(shí)間變化數(shù)據(jù)采集

選擇16倍稀釋后的MNBs進(jìn)行對(duì)比超聲造影，在造影增強(qiáng)區(qū)域中選取部分超聲造影區(qū)域(ROI)，讀取對(duì)比超聲造影的信號(hào)數(shù)值，按照時(shí)間變化進(jìn)行采集，每次采集間隔時(shí)間為2.5min進(jìn)行超聲數(shù)據(jù)采集，每次采集18s的超聲信號(hào)，超聲參數(shù)為18MHz，25dB，30% power，使用純水作為對(duì)照。

2.5 磁性納米氣泡的核磁共振造影

將磁性納米氣泡進(jìn)行不同比例的進(jìn)行稀釋(按照原濃度，8倍，16倍，32倍，64倍，128倍和256倍的濃度對(duì)磁性納米氣泡進(jìn)行稀釋)裝入1.5mL離心管中，使用7T磁場(chǎng)的核磁共振儀(Biospec7T/20USR7.0T小動(dòng)物核磁核共振成像系統(tǒng)，Bruker，德國(guó))進(jìn)行核磁成像進(jìn)行T1核磁造影成像，TE為8.9ms，TR為400ms，F(xiàn)A為90°。并采用純水和磷脂溶液作為對(duì)照組。使用相同的稀釋比例對(duì)磁性納米氣泡進(jìn)行了T2造影成像，TE為80ms，TR為2200ms，F(xiàn)A為90°。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 磁性納米氣泡的形貌表征結(jié)果

如圖3所示，在掃描電子顯微鏡的圖像中，MNBs整體形態(tài)呈現(xiàn)出球形，其膜殼表面粗糙且附著有約10nm的磁性納米顆粒，掃描電子顯微鏡中的MNBs的直徑約700nm。而在透射電鏡圖像中可以觀察到磁性納米顆粒大致形狀為一個(gè)圓形，邊緣為磷脂膜殼，在膜殼上同樣可以看見許多磁性納米顆粒吸附，這進(jìn)一步表明MNBs膜殼表面有磁性顆粒聚集。同時(shí)透射電鏡圖像中能看出中心的氣體核心部分，且在光學(xué)顯微鏡明場(chǎng)的圖像中，MNBs呈現(xiàn)出亮的圓環(huán),其中心較為透亮(其中心為氣體核心)。磁性納米氣泡的掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡結(jié)果共同說(shuō)明了MNBs具有外部的膜殼結(jié)構(gòu)和中心的氣核，且磁性納米顆粒裝載于MNBs的膜殼上。

圖3 MNBs的形貌表征

3.2 磁性納米氣泡的粒徑、濃度的表征

根據(jù)粒徑表征結(jié)果可以看出，MNBs粒徑為(785.7±26.5)nm， 分散系數(shù)(PDI)為0.353，MNBs的Zeta電位為-22.7mV，MNBs的濃度為2.00×108個(gè)/mL。由濃度表征結(jié)果可知MNBs的粒徑主要是1μm以下，粒徑在1μm以上的數(shù)量較少，說(shuō)明MNBs尺寸主要為納米級(jí)。

3.3 磁性納米氣泡的超聲造影結(jié)果

從磁性納米氣泡各個(gè)濃度的超聲造影結(jié)果中可以看出8至16倍稀釋時(shí)(濃度約為1.25～2.5×107個(gè)/mL)有較好的超聲造影效果，相比于純水可以觀察到明顯的超聲造影差異。但是稀釋16倍以上時(shí)，濃度的降低會(huì)導(dǎo)致磁性納米氣泡的造影效果降低，最終不能形成一個(gè)完整的圓形。所以本實(shí)驗(yàn)所制備的磁性納米氣泡的最佳造影稀釋濃度為稀釋8至16倍。

選擇16倍稀釋的MNBs濃度(1.25×107個(gè)/mL)進(jìn)行超聲的時(shí)間掃描，每隔2.5min進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果的記錄，由超聲數(shù)值結(jié)果可知磁性納米氣泡與純水的超聲造影在數(shù)值上存在明顯差異，純水?dāng)?shù)值較低且基本保持不變，而MNBs的超聲數(shù)值信號(hào)較大，隨時(shí)間延長(zhǎng)超聲數(shù)值緩慢降低。

3.4 磁性納米氣泡的核磁共振造影效果

由于病變組織在T1成像較暗，所以使用的T1造影劑提高成像亮度才能增強(qiáng)造影，所以需要比純水的圖像亮[2,3]。而病變組織與正常組織在T2成像都較亮，所以T2造影劑使病變區(qū)域變暗才能突出區(qū)別，所以需要比純水的圖像暗[2,3]。MNBs稀釋到合適的倍數(shù)時(shí)能增強(qiáng)T1造影成像效果。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T1造影時(shí)8至16倍為合適的稀釋倍數(shù)，此時(shí)MNBs(1.25～2.5×107個(gè)/mL)成像亮度比純水亮，有T1造影增強(qiáng)效果。當(dāng)T2造影時(shí)，加入不同濃度的MNBs成像都比純水暗，所以MNBs有T2造影增強(qiáng)效果。

圖7 MNBs的對(duì)比超聲時(shí)間變化數(shù)值結(jié)果

圖8 MNBs的核磁共振造影效果

4 總結(jié)與展望

本文成功制備了超聲和核磁共振雙模態(tài)造影的磁性納米氣泡，并且通過(guò)掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡觀察到了其顆粒包覆的膜殼和氣體核心的結(jié)構(gòu)。并測(cè)定了磁性納米氣泡的粒徑和濃度，確定了其粒徑為納米級(jí)別。最后進(jìn)行了超聲和磁共振造影,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8至16倍的濃度稀釋可以有較好的超聲和T1的核磁成像效果，而不同濃度稀釋的磁性納米氣泡都有較好的T2造影效果。

在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中如果能夠增加一些其他的納米顆粒如金納米顆粒，就能進(jìn)一步制備超聲、核磁和CT的三模態(tài)造影增強(qiáng)劑。而目前的多模態(tài)造影劑需要進(jìn)一步研究如何利用更廉價(jià)的材料或者提高材料的利用效率和造影效果，從而實(shí)現(xiàn)降低單瓶造影劑的售價(jià)。