二代測序在顱內(nèi)感染患者中的臨床應(yīng)用分析

周睿姣，廖品文

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000)

0 引言

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system CNS)感染性疾病是病原微生物侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)的實質(zhì)、被膜及血管等引起的急性或慢性炎癥性(或非炎癥性)疾病，屬于神經(jīng)系統(tǒng)疾病中較常見較危重的一類疾病[1]。人類CNS感染的病原微生物包括病毒、細菌、結(jié)核分枝桿菌、真菌、螺旋體、寄生蟲、朊蛋白等，具有各年齡段均可累及，發(fā)病率高、病情進展迅速、致殘致死率高等特點。早期盡快進行病因?qū)W診斷、明確具體病原微生物類型對疾病的治療及改善患者預(yù)后有至關(guān)重要的作用[2]?；颊叩陌Y狀體征、病程特點、常規(guī)實驗室檢查及影像學(xué)檢查對疾病的診斷均有重要價值，但實驗室檢驗中的必選項-腦脊液培養(yǎng)是細菌性CNS感染的診斷金標準，但細菌培養(yǎng)周期長，且檢出率低下，難以滿足臨床需求，僅依靠這些方法明確顱內(nèi)感染病原學(xué)診斷往往比較困難而且確診率較低，因此顱內(nèi)感染的臨床診斷缺乏直接高效率的實驗室證據(jù)支持[3]?；诖耍珻NS感染疾病治療多以經(jīng)驗性抗感染治療為主，因?qū)Σ≡N類推斷不準確，往往導(dǎo)致初治失敗情況，導(dǎo)致病情惡化、延誤治療，甚至造成患者死亡的危險。

近年來，二代基因測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)作為一種病原學(xué)檢測新方法在臨床上應(yīng)用越來越廣泛，其基于高通量、無偏倚，可以同時測定幾百萬條DNA 的序列，實現(xiàn)快速的全基因組測序的分子診斷技術(shù)能快速檢測并明確中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原微生物[4,5]。NGS可以直接從患者病變腦組織、腦脊液甚至尿液中獲取病原微生物信息，檢測周期短，信息準確率高，是一種非常有應(yīng)用前景的病原學(xué)檢測方法?？朔藗鹘y(tǒng)的針對性診斷方法的局限性。理論上，幾乎所有的微生物都可以基于特定的核酸序列進行唯一鑒定，所以NGS 對于復(fù)雜、少見病原菌感染及新型致病微生物的檢出存在明顯優(yōu)勢。在CNS感染早期盡快進行NGS檢測具有以下優(yōu)勢：一方面利于疾病的及時確診和治療；其次，目前關(guān)于NGS 在CNS 感染中的應(yīng)用個案報道非常普遍，但仍缺乏大樣本的規(guī)模研究[6]。

本研究回顧性分析川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2020年6月1日至2021年7月31日收治的69名顱內(nèi)感染患者送檢的mNGS的檢測結(jié)果進行分析，了解顱內(nèi)感染患者的病原菌分布情況，患者的住院天數(shù)及出院時情況，并與傳統(tǒng)病原菌檢測方法相比較，以期為NGS的臨床應(yīng)用價值提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 入組標準

收集2020年6月1日至2021年7月31日川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的顱內(nèi)感染患者病例,腦脊液二代測序入組標準符合《北京腦炎協(xié)作組腦炎診斷標準》[8]。排除標準包括：年齡≤28 d；腦脊液細胞學(xué)證實腦膜惡性腫瘤；損傷所致明顯血性腦脊液；已經(jīng)確診自身免疫性腦炎的病例；其他器官疾病嚴重有生命危險的病例；HIV、梅毒感染或者拒絕簽署知情同意書。最終共69例感染性腦炎/腦膜炎/腦膜腦炎患者入組，其中女性患者40例，男性患者29例;年齡最小者為22歲，年齡最大者為78歲; 患者及其家屬均簽署知情同意書，抽取適量腦脊液，送天津華大醫(yī)學(xué)檢驗所進行mNGS檢測，同時進行腦脊液的常規(guī)、生化、細胞學(xué)、病毒抗體、病原菌涂片和血培養(yǎng)、PCR等檢查驗證試驗。腦脊液送檢至NGS報告時間為3-5個工作日。本研究通過川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

回顧性分析所有納入研究患者，將腦脊液采用傳統(tǒng)檢測方法檢測、未外送二代測序患者歸為常規(guī)組，外送腦脊液二代測序患者歸為NGS組，分析兩組患者基本情況，分析入院后腰穿抽取腦脊液進行腦脊液常規(guī)、腦脊液生化、一般細菌涂片、抗酸染色、墨汁染色、病原菌培養(yǎng)的結(jié)果。分析腦脊液外送宏基因二代測序結(jié)果。腦脊液mNGS由天津華大醫(yī)學(xué)檢驗所進行病原菌高通量測序檢測，采用IlluminaMiniSeq/NextSeq測序平臺進行測序。測序，結(jié)果以紙質(zhì)版報告的形式呈現(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)收集

收集納入的每位患者基本信息，包括性別、年齡(歲)、入院時間、出院時間以及腦脊液培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果(具體病原微生物)、經(jīng)二代測序所測得的微生物病原學(xué)結(jié)果，精確到病原菌種屬；統(tǒng)計每位入組患者的出院轉(zhuǎn)歸，包括好轉(zhuǎn)、治愈、未愈、其他形式。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用t檢驗，結(jié)果用均數(shù)±標準差(±s)表示，分類數(shù)據(jù)采用Fisher檢驗和卡方檢驗進行比較。偏態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)(四分位數(shù))表示，計數(shù)資料用百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

嚴格按照納排標準，共納入2020年6月1日至2021年7月31日川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的69例被確診為感染性腦炎/腦膜炎/腦膜腦炎患者，根據(jù)住院期間患者是否行腦脊液病原菌二代測序檢測并取得檢測結(jié)果，將未行二代測序的患者歸為常規(guī)組，已行二代測序的患者歸為NGS組。首先進行兩組間的基線水平分析，包括性別與年齡統(tǒng)計比較，常規(guī)組女性患者25例，男性患者18例，NGS組女性患者15例，男性患者11例(P>0.05)；常規(guī)組年齡(44.17±15.32)歲，NGS組年齡(44.35+15.48)歲(P>0.05)?；€如表1所示。

表1 兩組患者的性別、年齡基線水平比較

2.2 結(jié)合腦脊液NGS檢查結(jié)果的臨床診斷統(tǒng)計

在NGS組中，統(tǒng)計病原體檢測陽性并與臨床診斷相符的26例患者的臨床診斷：提示由病毒感染引起的腦炎16例(主要由皰疹病毒1、3、4型感染)，由結(jié)核桿菌感染引起的腦膜炎3例，由病毒感染引起的腦膜炎2例，由肺炎球菌、腦膜炎雙球菌引起的化膿性腦膜炎2例，由結(jié)核桿菌引起的腦膜腦炎1例，由新型隱球菌感染引起的腦炎1例，由新型隱球菌感染引起的腦膜炎1例(圖1)。

圖1 NGS組疾病分類

2.3 住院天數(shù)

統(tǒng)計常規(guī)組和NGS組各組患者的入院時間和出院時間，分析各組患者的總住院天數(shù)，常規(guī)組43例患者的平均住院天數(shù)為18.23±1.13天，其中最長住院天數(shù)為33天，最短住院天數(shù)為4天；NGS組26例患者的平均住院天數(shù)為14.23±1.09天，其中最長住院天數(shù)為26天，最短住院天數(shù)為4天(*P<0.05)(圖2)。

圖2 兩組患者的住院天數(shù)比較

2.4 出院時轉(zhuǎn)歸

按照納入患者病歷首頁的出院時情況，分為好轉(zhuǎn)、治愈、未愈、其他4種轉(zhuǎn)歸，統(tǒng)計各組患者的不同轉(zhuǎn)歸情況的人數(shù)，常規(guī)組患者出院時好轉(zhuǎn)27人，占該組總?cè)藬?shù)的63%，治愈1人，占該組總?cè)藬?shù)的2%，未愈7人，占該組總?cè)藬?shù)的19%，其他8人，占該組總?cè)藬?shù)的16%；NGS組患者出院時好轉(zhuǎn)18人，占該組總?cè)藬?shù)的69%，治愈5人，占該組總?cè)藬?shù)的19%，未愈2人，占該組總?cè)藬?shù)的7%，其他1人，占該組總?cè)藬?shù)的5%(*P<0.05)(圖3)。

圖3 兩組患者的出院轉(zhuǎn)歸情況

3 討論

本研究回顧性分析了川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的單中心數(shù)據(jù)，這些研究資料來源于實際的神經(jīng)科臨床工作。本單中心的回顧性研究結(jié)果顯示，顱內(nèi)感染患者的流行病學(xué)在性別上無明顯差異，男女感染幾率相近；與腦血管疾病的易感年齡段來看，顱內(nèi)感染患者的年齡普遍較年輕；在引起中樞神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)感染的病毒中，人皰疹病毒1、3、4型最多見，以上發(fā)現(xiàn)與既往文獻報道一致[7,8]。由于神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病屬于神經(jīng)系統(tǒng)疾病中較常見的一類，且具有起病急、癥狀重、預(yù)后差的特點。其治療方案的選定取決于引起顱內(nèi)感染的病原微生物種類，種類不同，治療方案將大相徑庭，治療是否及時將嚴重影響患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸。此前，臨床嚴重依賴腦脊液生化、常規(guī)、鏡檢及培養(yǎng)結(jié)果，結(jié)合頭顱影像學(xué)檢測結(jié)果，鑒別診斷。但由于腦脊液鏡檢及培養(yǎng)的陽性率低下且周期較長，且有些患者腦脊液生化常規(guī)不典型，嚴重影響臨床醫(yī)生對以上結(jié)果的判讀及對患者疾病的診斷與治療，若臨床經(jīng)驗不足，可能嚴重影響治療效果及患者的預(yù)后[9,10]。近來，隨著基于分子層面的NGS的臨床應(yīng)用發(fā)展，有學(xué)者比較研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合NGS診斷的49例CNS感染病例經(jīng)抗感染治療效果明顯，證明與傳統(tǒng)病原體檢測方法相比較，mNGS給臨床醫(yī)生診斷與治療決策提供了很大幫助，證實腦脊液mNGS的應(yīng)用是非常必要的。以往的PCR方法都有賴于預(yù)設(shè)目標的病原微生物基因序列，而mNGS的無偏倚、隨機的特性使其不僅可以檢測基因組已知的病原體，還可以檢測未知的新型病原微生物，從而成為發(fā)現(xiàn)新發(fā)感染性疾病的重要方法[11]。

目前，mNGS技術(shù)作為新型的病原微生物檢測技術(shù)，費用較傳統(tǒng)病原微生物檢測技術(shù)昂貴，對于病情反復(fù)，治療期間合并新的感染的患者，難以通過本方法監(jiān)測致病菌的變化，且無法同步給出藥敏結(jié)果，故只能經(jīng)驗性應(yīng)用抗感染方案。此外，目前的mNGS技術(shù)對RNA 病毒檢測尚有不足，胞內(nèi)菌如結(jié)核分枝桿菌的檢測由于序列數(shù)過低，對臨床結(jié)果解讀有一定影響。以上不足限制了該技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用，近來隨之技術(shù)的發(fā)展，NGS技術(shù)逐步開始探索RNA病毒的檢測效能，并取得令人鼓舞的消息[12]。雖然，腦脊液mNGS還有待進一步完善與標準化，但已經(jīng)為感染性腦炎與腦膜炎病因診斷帶來了顯著的進步。這種診斷方法為歷來顱內(nèi)感染檢測診斷技術(shù)帶來跨越式發(fā)展，為病原菌的診斷識別提供精準指導(dǎo)，促進疾病的早期診斷和隨后的針對性治療，從基因?qū)用娉晒テ菩鲁霈F(xiàn)的感染病原體和新發(fā)感染性疾病。在臨床實踐中，我們需要進一步探索腦脊液mNGS在CNS感染性疾病中的臨床適應(yīng)證，同時由于NGS靈敏度非常高，致病病原菌的檢測易受背景菌及標本污染的影響，因此在標本采集及運送過程的要求更為嚴格[13]。因NGS的檢測價格高昂，應(yīng)用mNGS要考慮患者病情的嚴重程度和醫(yī)療資源的具體情況等因素。在病原體診斷技術(shù)相對落后的基層醫(yī)院和臨床實踐中如何合理應(yīng)用mNGS，并與傳統(tǒng)微生物檢測方法相結(jié)合，以提高神經(jīng)感染性疾病的診治水平，仍然是需要深入探索與探討的問題。結(jié)合本研究分析，針對考慮顱內(nèi)感染患者，建議盡早完善NGS檢測，盡早明確病原菌從而及時進行精準治療，減少臨床對顱內(nèi)感染患者的誤診，做到精準治療及精確診斷，及時糾正病原菌對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，減少患者疾病時限，盡量減少病原菌對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，改善預(yù)后[14-17]。