基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討麻杏石甘湯治療急性支氣管炎 的作用機制

繆佩鳳

(東興市人民醫(yī)院，廣西 東興 538051)

0 引言

急性支氣管炎主要由感染或其他非感染因素如過敏、吸煙、空氣污染等所致，臨床表現(xiàn)為咳痰咳痰、發(fā)熱、喘息等，病理表為氣管-支氣管黏膜的急性炎癥反應(yīng)，為臨床常見的肺系疾病[1,2]。嬰幼兒及老年人易發(fā)病，好發(fā)于冬春季節(jié)，且本病起病急驟、變化快甚至可造成患者死亡，因此及時治療非常必要[1]。

麻杏石甘湯是《傷寒論》中的經(jīng)典方劑，主要由麻黃，杏仁，石膏和甘草四味中藥組成，用于太陽病的治療，后世多用于治療風(fēng)寒化熱或風(fēng)熱犯肺，現(xiàn)代臨床上廣泛用于急性支氣管炎的治療[3]。臨床研究表明加用麻杏石甘湯治療急性支氣管炎在炎癥指標恢復(fù)時間、退熱時間、咳嗽時間、肺部啰音消失時間及總有效率等方面都優(yōu)于單純的西醫(yī)治療[4,5]。

為探討麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的機制，本文將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)，構(gòu)建麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，利用KEGG分析和GO分析確定其活性通路和活性基因。利用分子對接技術(shù)研究麻杏石甘湯的關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點之間的相互作用，并利用基因注釋驗證上述關(guān)鍵靶點，以期為進一步實驗研究、臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分的獲取與活性成分的篩選

從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)檢索甘草、麻黃、苦杏仁和石膏的成分。根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類 藥 性(drug-likeness，DL)≥0.18初步篩選出活性成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取活性成分相應(yīng)的蛋白靶點，并刪除不含有靶點的成分。通過STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫將收集到的蛋白靶點轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的基因名稱(gene symbol)，其中物種來源選擇人源性(Homo sapiens)。

1.2 篩選麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的潛在靶點

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，以“acute bronchitis”作為關(guān)鍵詞檢索疾病相關(guān)靶點，獲取急性支氣管炎相關(guān)的疾病靶點。利用在線網(wǎng)站Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將疾病靶點與“1.1”中獲得的成分靶點取交集，最終獲得麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的候選靶點。

1.3 靶點蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.2中的候選靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“homo sapiens”，置信度設(shè)置為0.4，對篩選出的候選靶點進行蛋白互作關(guān)系分析。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(nodes)代表靶蛋白，邊(edges)代表靶蛋白之間的互相作用，度值(degree)代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)量，度值越高表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)后，將文件導(dǎo)入Cytoscape(3.6.0)軟件，并利用Cytohubba插件對網(wǎng)絡(luò)進行關(guān)鍵靶點分析，按照degree排名，排名前五位的可認為是麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的關(guān)鍵靶點。

1.4 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape構(gòu)建麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，同時采用Cytohubba插件對其進行關(guān)鍵成分分析。按照degree排名，排名前五位的可認為是麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的關(guān)鍵成分。

1.5 生物過程分析

將篩選出的潛在靶點，利用Metascape(http://metascape.org/)數(shù)據(jù)庫，對麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的靶點進行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析與GO生物學(xué)過程分析。利用Omicshare(https://www.omicshare.com/)在線繪圖網(wǎng)站繪制KEGG信號通路中排名前20的氣泡圖。

1.6 靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用Cytoscape軟件構(gòu)建KEGG信號通路中排名前20的靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 分子對接

利用Autodock4.2.6、AutodockTools1.5.6、pymol2.5和python2.5軟件對1.3得到的關(guān)鍵靶點及1.4得到的關(guān)鍵成分進行半柔性對接。結(jié)合能小于0kJ·mol-1 則表明有自發(fā)結(jié)合的可能。

1.8 關(guān)鍵靶點的基因注釋

利用KEGG(https://www.kegg.jp/)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中KEGG Mapper功能，將PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值排名最高的5個關(guān)鍵靶點在信號通路圖中標注出來，驗證麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的主要信號通路。

2 結(jié)果

2.1 活性成分的篩選結(jié)果

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中找到麻杏石甘湯中4味中藥的成分，并根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18進一步篩選、去重后共得到候選成分123個。將候選成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取其相應(yīng)的蛋白靶點信息，通過STRING數(shù)據(jù)庫將蛋白靶點轉(zhuǎn)換為基因名稱，剔除重復(fù)后共獲得238個潛在基因靶點(表1)。

表1 麻杏石甘湯候選成分的具體信息

2.2 潛在靶點篩選結(jié)果

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中找到急性支氣管炎相關(guān)靶點共1629個，將疾病相關(guān)靶點與麻杏石甘湯的成分靶點分別輸入韋恩圖在線繪制網(wǎng)站(Venny)中，繪制維恩圖，圖1。合并后共得到129個潛在靶點。

圖1 藥物-疾病靶點維恩分析圖

2.3 關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件，對麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的129個潛在靶點進行PPI分析。結(jié)果顯示129個節(jié)點共有2675條邊，degree值排名前五的靶點依次為：AKT1，TP53，IL6，CASP3，VEGFA。這5個靶點可認為是麻杏石甘湯治療AB的關(guān)鍵靶點(圖2)。

圖2 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

利用Cytoscape軟件建立藥物-成分-靶點-疾病的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。利用CytoHubba插件分析，按degree值篩選出排名前五的活性成分，依次為槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、柚皮素(Naringenin)、光甘草定(Glabridin)。網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示麻杏石甘湯為多成分、多靶點治療急性支氣管炎的作用機制。

圖3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 KEGG通路富集和GO分類富集分析結(jié)果

利用Metascape數(shù)據(jù)庫，以最小計數(shù)為3、P<0.01、富集因子>1.5為篩選條件，對篩選出來的129個潛在靶點(選擇H.sapiens)，進行KEGG通路富集分析和GO分類富集分析。

KEGG通路富集分析共獲得280條通路，對KEGG分析結(jié)果的前20條通路通過Omicshare在線網(wǎng)站進行可視化處理，得到高級氣泡圖。其中氣泡面積大小代表基因數(shù)量，氣泡顏色代表P值的大小，即富集顯著性，見圖4。篩選出的信號通路與疾病相關(guān)的主要有：PI3K/AKT信號通路、IL-17信號通路 、細胞老化、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O信號通路、松弛素信號通路、NF-κB信號通路、JAK-STAT信號通路、程序性壞死、長壽調(diào)節(jié)途徑、鈣信號通路、線粒體和產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)。

圖4 KEGG通路富集分析(上部分氣泡圖，下部分柱狀圖)

GO生物過程功能富集分析共獲得429個條目，見圖5。其中生物過程(biological process)251個，涉及對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、對無機物的反應(yīng)和凋亡信號通路等；分子功能(molecular function)92個，涉及蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等；細胞組分(cellular component)86 個，涉及膜筏、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物和轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等。

圖5 GO分析圖(由上至下分別為：GO-BP，GO-CC，GO-MF)

2.6 靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

為進一步直觀的顯示麻杏石甘湯治療急性支氣管炎涉及KEGG通路及靶點的關(guān)系，使用Cytoscape構(gòu)建了“靶點-信號通路”的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。該通路圖中共有90個節(jié)點，189條邊，平均度值為4.2。KEGG通路中PI3K/AKT信號通路度值最高，為35，其次為IL-17信號通路、細胞老化、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O信號通路等。

圖6 麻杏石甘湯治療AB“靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對接

利用Autodock對配體和受體進行半柔性對接，結(jié)果顯示quercetin，Kaempferol，Luteolin，Naringenin，Glabridin等5個關(guān)鍵成分與AKT1，TP53，IL-6，CASP3，VEGFA等5個關(guān)鍵靶點之間均有較強的結(jié)合能力。結(jié)合能(binding energy)<-5 kcal·mol-1的 有24對，<-7.0 kcal·mol-1的 有4對，其 中ATK1- Glabridin的結(jié)合能最低，為-8.95 kcal·mol-1，具體對接結(jié)果見表2。

表2 核心成分與核心靶點對接結(jié)果

2.8 關(guān)鍵靶點的基因注釋結(jié)果

利用KEGG數(shù)據(jù)庫的KEGG Mapper功能將5個關(guān)鍵靶點，在PI3K/AKT信號通路中用紅色標注出來，結(jié)果顯示有4個靶點參與PI3K/AKT信號通路的相關(guān)調(diào)控，結(jié)果見圖7。

圖7 麻杏石甘湯調(diào)控急性支氣管炎信號通路靶點(紅色標記)

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，表明了麻杏石甘湯多成分、多靶點、多信號通路協(xié)同發(fā)揮作用的特點。其關(guān)鍵成分很可能為槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、光甘草定。藥理作用研究顯示槲皮素，山奈酚具有改善氣道炎癥、抗病毒及防止咳嗽的作用[6-8]。木犀草素對支氣管炎具有解痙的作用[9]。柚皮素為黃烷酮類化合物，具有抗病毒和抗炎的雙重作用[10]。光甘草定為類黃酮化合物，具有多種藥理活性，對于氣道炎癥的藥理活性包括抗氧化作用、抗炎作用及改善呼吸功能等[11]。

麻杏石甘湯活性成分治療急性支氣管炎所調(diào)控的靶點互作網(wǎng)絡(luò)表明，關(guān)鍵靶點很可能為AKT1、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA。KEGG通路分析和GO分子功能富集分析闡明了麻杏石甘湯多功能、多靶點、多通路治療的機制，相關(guān)的通路有PI3K/AKT信號通路、IL-17信號通路、細胞老化、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O信號通路、松弛素信號通路、NF-κB信號通路、JAKSTAT信號通路、程序性壞死、長壽調(diào)節(jié)途徑、鈣信號通路、線粒體和產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)等。結(jié)合本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果及相關(guān)文獻回顧，麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的潛在機制可進一步歸納為以下方面。

3.1 抑制細胞增殖

3.1.1 抑制AKT1蛋白激活

研究表明，PI3K/AKT信號通路及下游信號因子在慢性炎癥中炎癥介質(zhì)的表達、活化、炎癥細胞募集、免疫細胞功能、氣道重塑和皮質(zhì)類固醇不敏感中起著至關(guān)重要的作用。來自動物模型，原代細胞和其他疾病臨床研究的數(shù)據(jù)表明，PI3K/AKT抑制劑可作為潛在的治療炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病包括哮喘的新療法[12]。AKT1是PI3K/AKT信號通路重要的游靶標，可參與生長因子、細胞因子等激活下游靶標的細胞信號傳導(dǎo)[13]。AKT1可抑制AKT磷酸化減弱人支氣管平滑肌增殖，以減輕氣道重塑[14]。分子對接結(jié)果顯示AKT1蛋白與槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、光甘草定的結(jié)合能均小于-5.0 kcal·mol-1，提示AKT1很可能為這五個關(guān)鍵活性成分的靶標之一。槲皮素、木犀草素、柚皮素均有研究表明可抑制PI3K激活而發(fā)揮抑制支氣管炎癥、減輕氣道重塑的作用[15-17]。據(jù)此，槲皮素、木犀草和柚皮素與AKT1蛋白結(jié)合，抑制支氣管炎癥、減少氣道重塑很有可能是麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的機制之一。

3.1.2 抑制IL-6生成

IL-6是炎癥反應(yīng)的重要因子之一，有研究表明IL-6在人體中參與了多種炎癥性疾病的發(fā)生，屬于一種促炎因子[18]。有研究表明，槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素和光甘草定在IL-17信號通路，抑制IL-6的生成、改善上呼吸道感染癥狀有積極的意義[19,20]。

3.2 調(diào)節(jié)鈣信號通道

氣道平滑肌的收縮力增強需要細胞內(nèi)鈣濃度升高，在靜息狀態(tài)下，氣道平滑肌細胞維持相對較低的細胞內(nèi)鈣濃度，并通過激動劑對表面受體的激活致使細胞內(nèi)鈣濃度升高，最終導(dǎo)致細胞收縮。促炎因子參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)途徑的表達與活性，從而導(dǎo)致氣道平滑肌細胞高反應(yīng)性[21]。有研究表明槲皮素、柚皮素及光甘草定均可抑制細胞因子產(chǎn)生，激活大電導(dǎo)的Ca2+活化的K+通道來松弛氣管平滑肌，介導(dǎo)質(zhì)膜超極化并減少Ca2+流入[22-24]。

3.3 調(diào)節(jié)線粒體功能

線粒體在Ca2+調(diào)節(jié)、氧化還原調(diào)節(jié)和細胞生物學(xué)方面具有多種多樣但相互聯(lián)系的作用，對于氣道平滑肌的生理變化也起到至關(guān)重要的作用。越來越多的研究表明線粒體功能障礙與氣道疾病密切相關(guān)[25]。槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素和光甘草定均有文獻報道能夠調(diào)節(jié)線粒體功能，保護相關(guān)的細胞免受氧化應(yīng)激[26-29]。

急性支氣管炎是由感染、物理、化學(xué)刺激或過敏等因素引起的急性氣管-支氣管黏膜炎癥，常發(fā)生于寒冷季節(jié)或氣溫突然變冷時，藥物治療的原則主要為鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙抗過敏和抗感染治療[30]。麻杏石甘湯作為《傷寒論》中的經(jīng)典方劑，對咳嗽、支氣管炎、肺炎等多種肺部疾病均有良好的治療效果，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、解熱、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，“清”“ 透”結(jié)合，宣肺清熱[3,31]。本研究初步表明麻杏石甘湯治療急性支氣管炎為多成分、多靶點和多通路的的模式。其潛在的機制為抑制細胞增殖，調(diào)節(jié)鈣信號通道和調(diào)節(jié)線粒體功能。但尚有部分通路和機制未得到驗證，本研究可以為之后進一步的研究提供思路和科學(xué)依據(jù)。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)有一定的局限性，不能完全表達中醫(yī)藥復(fù)方的有效成分及其相關(guān)作用機制，由此結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果仍需后續(xù)體內(nèi)外試驗的觀察與驗證[32]。