UPLC 同時(shí)測定丹參藥材中丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的含量分析

曹 莉

（鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院藥劑科 江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

藥材丹參的主要藥效成分為丹酚酸B（salvianolic acid B, SLB）和丹參酮ⅡA（tanshinone IIA, TNA）[1]。許多研究表明SLB 和TNA 可以改良心臟灌注功能，優(yōu)化自由基侵蝕情況，這兩種物質(zhì)可以在一定程度上反應(yīng)丹參藥材的藥效情況。在藥典中，通過對SLB 和TNA 的含量情況進(jìn)行控制來反映藥材丹參的質(zhì)量程度。先前有研究使用HPLC 法檢測這兩種成分的含量，但由于此法較為耗時(shí)，當(dāng)面臨較多檢測量時(shí)無法滿足測定要求。不同于傳統(tǒng)的HPLC 法，超高效液相色譜法（UPLC）具有較高的分離度和更快的分析速度。UPLC 法檢測藥材丹參含量相比于HPLC 法具有更大優(yōu)勢。

丹參，是一種廣泛使用的中藥，用于治療冠心病、腦血管病、肝硬化和細(xì)菌感染。丹參是大量活性天然化合物的重要來源，這些活性天然化合物主要分為水溶性和脂溶性（二萜）組分。SLB 是丹參的主要水溶性提取物之一，TNA 是活性最高的二萜醌類色素[2]。兩者都因其廣泛的藥理活性而被廣泛研究。

1.儀器與試藥

采用Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC 系統(tǒng)，UltiMate 3000 泵，UHPLC 自動(dòng)進(jìn)樣器，Vanquish ?柱溫箱，光電二極管陣列（PDA）檢測器以及Standard Instrument Integration（SII）管理軟件。SLB 和TNA 標(biāo)準(zhǔn)對照品來自于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化中心，純度＞99%。藥材丹參由安徽中醫(yī)藥大學(xué)陳亮鑒定為Salvia miltiorrhiza。

2.方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Accucore ? Vanquish ? C18+超高效液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）流動(dòng)相為Acetonitrile-0.1%Formic acid 水溶液，梯度洗脫，流速0.6 mL 每分鐘；檢測波長為280 納米，柱溫30 度。按照此條件對藥材丹參進(jìn)行分離（R ＞2），對稱性佳（0.99 ～1.01）。

2.2 對照品溶液的制備

按照千分之一的準(zhǔn)確度稱取標(biāo)準(zhǔn)對照品SLB 和TNA一定量，導(dǎo)入10 mL 容量瓶中，再導(dǎo)入濃度為75%的甲醇水溶液，震蕩溶解，再添加75%甲醇至容量瓶刻度線可得標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液。

2.3 樣品溶液配制

按照千分之一的準(zhǔn)確度稱取藥材丹參300 mg 倒入20 mL 試管中，震蕩溶解，稱重后補(bǔ)重。離心后取上清液再用甲醇稀釋。再度離心取上清液倒入容量瓶可得樣品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

按照千分之一的準(zhǔn)確度稱取標(biāo)準(zhǔn)對照品一定量，采用75%甲醇進(jìn)行稀釋，得到：SLB 溶液7.59，13.39，15.25，379，759 μg/mL；TNA 溶 液1.20，2.37，6.01，60.1，120 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液。通過分開進(jìn)樣3 μL，共三次進(jìn)樣。按照質(zhì)量濃度為X 軸，色譜峰面積為Y 軸，通過軟件計(jì)算回歸方程。SLB：Y = 11.89X+1.59，R = 0.9998；TNA：11.78X+4.97，R = 0.9997。 從 色 譜結(jié)果可以得出SLB 在7.59 ～759 μg/mL,TNA 在1.20 ～120 μg/mL 線性相關(guān)度良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

按照千分之一的準(zhǔn)確度抽取標(biāo)準(zhǔn)對照品SLB 和TNA的混合溶液。反復(fù)進(jìn)樣9 次，色譜結(jié)果表明SLB 和TNA的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09%和0.08%，精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按照千分之一的準(zhǔn)確度抽取樣品溶液3 μL，在一天內(nèi)反復(fù)進(jìn)樣12 次，評價(jià)藥材丹參的穩(wěn)定性情況。結(jié)果顯示SLB 和TNA 的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.3%，樣品溶液在一天內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照千分之一的準(zhǔn)確度稱量300 mg 丹參藥材6 份，配制為樣品溶液，再行檢測。使用方程計(jì)算，結(jié)果顯示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.11%。表明本法有較好重復(fù)性。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

按照千分之一的準(zhǔn)確度稱量丹參藥材150 mg，再加入SLB 和TNA 標(biāo)準(zhǔn)對照品一定量，并按照上述方案進(jìn)行處理，在完成色譜分析后發(fā)現(xiàn)，測定均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為100.09%，0.43%；100.05%，0.79%。

2.9 樣品檢測

使用上述方案配制樣品溶液，并在上述各種條件下開展測定工作。記錄結(jié)果后使用方程計(jì)算SLB 和TNA 的含量情況，見表1。

表1 樣品中SLB 與TNA 的含量情況（mg/g）

3.討論

3.1 UPLC 與HPLC 的差異

高效液相色譜或高壓液相色譜是最流行、最現(xiàn)代、最強(qiáng)大和最通用的色譜分離技術(shù)之一，通常用于從復(fù)雜混合物（如草藥提取物或產(chǎn)品）中分離、鑒定和定量成分，并獲得粗混合物的化學(xué)圖譜或指紋圖譜。高效液相色譜可以說是定性和定量測定天然產(chǎn)品提取物、餾分或成品中化合物的最廣泛使用的分析分離技術(shù)。UPLC 是一種先進(jìn)的液相色譜技術(shù)，具有分析時(shí)間短、流動(dòng)相溶劑用量少的特點(diǎn)[3]。它還能提供更高的分離效率和分析物混合物的分辨率。UPLC 和HPLC 本質(zhì)上是相同的技術(shù)，不應(yīng)混淆為不同的技術(shù)。UPLC 儀器的主要特征是亞2 μm 的顆粒，而不是傳統(tǒng)的HPLC 系統(tǒng)中的2.5 ～10 μm 的顆粒。較小的顆粒（＜2 μm）需要更高的壓力才能工作，因此，UPLC必須能夠達(dá)到6 000 psi以上，這通常是HPLC的上限。

在UPLC 中，由于樣品粒徑較?。ǎ? μm），樣品與固定相之間的擴(kuò)散路徑較短，效率較高。最近引入的固體核心顆粒被包裹在小顆粒的表面，提供了更小的擴(kuò)散路徑和更高的效率。UPLC 使植物化學(xué)家能夠比以前更快地解決與從各種基質(zhì)中分離、檢測和定量各種次生代謝物相關(guān)的分析挑戰(zhàn)。在UPLC 中，運(yùn)行時(shí)間可分別比使用3 和5 μm 色譜柱的HPLC 系統(tǒng)縮短3 倍和9 倍。UPLC 系統(tǒng)由于提高了信噪比，能夠在非常低的濃度下檢測分析物，并且需要的進(jìn)樣量要小得多，而不會(huì)損失任何靈敏度。由于UPLC 與傳統(tǒng)的HPLC 不同的明顯優(yōu)勢，UPLC 現(xiàn)在已經(jīng)成為化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和藥物分析以及各種基質(zhì)中植物化學(xué)物質(zhì)分析的常規(guī)技術(shù)。

3.2 丹參的藥理學(xué)活性

丹參具有活血止痛的功效。其通過使用額外的機(jī)制，如抑制凋亡、抑制血小板脫顆粒、抑制肥大細(xì)胞脫顆粒、下調(diào)白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和抑制多種細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-a）和白細(xì)胞介素等，丹參研究在預(yù)防缺血-再灌注相關(guān)的微循環(huán)障礙方面具有巨大的意義。研究表明，其主要活性成分TNA 能明顯減少腦缺血再灌注后炎癥介質(zhì)的釋放，增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量，從而減輕腦水腫癥狀，有效減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷[4]。SOD 活性的水平間接反映了身體緩解自由基侵蝕的能力，而丙二醛的水平間接反映了機(jī)體的受創(chuàng)程度。研究顯示，TNA 能減輕大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，且隨著劑量的增加，神經(jīng)功能缺損的減輕效果更加明顯。并且TNA 能降低大鼠腦梗死體積和腦含水量，不同濃度的TNA 能降低缺血再灌注組缺血半球額葉和頂葉皮質(zhì)超氧化物歧化酶含量，增加丙二醛含量。研究表明，丹參客觀上對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

丹參提取物增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)的作用在缺氧性肺動(dòng)脈高壓中起重要作用，而增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)和磷酸化，誘導(dǎo)血管舒張和血壓降低。研究證明SLB 和TNA 顯著刺激了由鈉離子非依賴性系統(tǒng)y+載體介導(dǎo)的左旋精氨酸的攝取，這表明精氨酸通過質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)并沒有通過與鈉離子梯度的耦合而被激發(fā)。另有研究發(fā)現(xiàn)通過AMPK 途徑的一氧化氮合酶磷酸化外，SLB和TNA 還通過增加過氧化氫酶的表達(dá)來刺激左旋精氨酸的攝取。丹參可能在未來心肌缺血的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。然而，需要進(jìn)一步研究丹參介導(dǎo)的一氧化氮產(chǎn)生的機(jī)制和觀察到的心臟保護(hù)作用。