免疫親和凈化－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中玉米赤霉烯酮類真菌毒素

當(dāng)前在玉米赤霉烯酮類的真菌毒素檢測(cè)中，使用液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜的方法較多，本文則構(gòu)建了一種針對(duì)食品中6種玉米赤霉烯酮類真菌毒素的免疫親和凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法，包括玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮。本檢測(cè)方法的前處理工序非常簡便，利用免疫親和柱進(jìn)行凈化及液標(biāo)法進(jìn)行定量，能夠同時(shí)測(cè)定6種玉米赤霉烯酮類真菌毒素。除了谷物以外，本檢測(cè)方法還能應(yīng)用于肉、蛋、乳等食品的檢測(cè)。

一、材料和儀器

1.材料和試劑。（1）樣品：在市場(chǎng)購買大米、麥片、牛肉、豬肉脯、雞蛋、牛奶等當(dāng)作樣品，大米和麥片研磨成粉，牛肉和豬肉脯搗碎，雞蛋和牛奶混勻。

（2）試劑：乙腈，色譜純;乙酸鈉，分析純;玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)品、α-玉米赤霉烯醇標(biāo)準(zhǔn)品、β-玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)品、α-玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)品、β-玉米赤霉烯醇標(biāo)準(zhǔn)品、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品;玉米赤霉烯酮類免疫親和柱;β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯。

（3）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取10mg玉米赤霉烯酮類的各種標(biāo)準(zhǔn)品，置于10mL棕色容量瓶中，利用乙腈進(jìn)行溶解后定容，制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，在-18℃的條件下避光保存。

（4）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：取100μL上述制成的各類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，利用乙腈定容至10mL，制作成10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在-18℃的條件下避光保存。

2.儀器。GM200型刀式研磨儀;ACQUITYTM超高效液相色譜-TQS質(zhì)譜儀;組織搗碎機(jī);T18均質(zhì)器。

二、實(shí)驗(yàn)和方法

1.樣品處理方法。（1）谷物。取粉碎樣品25g，添加氯化鈉5g，再添加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙腈溶液100mL，攪拌提取2min，然后放于離心管（50mL）中，4000r/min離心5min。取10mL上層提取液，加水40mL并混勻，10000r/min離心5min。取20mL上清液，以每秒1-2滴的速度通過免疫親和柱，然后用水10mL淋洗親和柱2次，待空氣至親和柱中，并抽干小柱。利用乙腈2.0mL進(jìn)行洗脫，將洗脫液收集在玻璃試管中，再用氮?dú)猓?0℃以下）吹至近干。對(duì)殘留物則使用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈溶液0.5mL進(jìn)行再次復(fù)溶并混勻，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后待測(cè)。

（2）肉及肉制品、蛋、乳。取5g搗碎樣品放置在具塞離心管（50mL）中，添加5mL濃度為0.2mol/L 的乙酸鈉緩沖液與0.025mL的β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶并混勻，在37℃水浴中振蕩12h。水解后添加2g氯化鈉和20mL乙腈，高速均質(zhì)1min，超聲提取20min，10000r/min冷凍離心5min。取10mL上層提取液，加水40mL并混勻，10000? ? ?r/min離心5min。取20mL上清液，以每秒1-2滴的速度通過免疫親和柱，然后用水10mL淋洗親和柱2次，待空氣至親和柱中，并抽干小柱。利用乙腈2.0mL進(jìn)行洗脫，將洗脫液收集在玻璃試管中，再用氮?dú)猓?0℃以下）吹至近干。對(duì)殘留物則使用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈溶液0.5mL進(jìn)行再次復(fù)溶并混勻，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后待測(cè)。

2.測(cè)定方法。（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3，規(guī)格為100mm×2.1mm×1.8?m;柱溫：40℃;流速：0.3mL/min;進(jìn)樣體積：10μL;樣品室溫：15℃;流動(dòng)相：乙腈、水，梯度洗脫。

（2）質(zhì)譜條件。電離源：電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子模式;毛細(xì)管電壓：2.5kV;源溫度：150℃;錐孔電壓：20V;脫溶劑氣溫度和速度：500℃、800L/h;碰撞氣流速：0.22mL/min;錐孔氣流速：150L/h。

三、結(jié)果和分析

1.檢出限、定量限、線性范圍。配制質(zhì)量濃度為? ? ? ? ?0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10.0? ? ?μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L的6種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，開展超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，以加標(biāo)樣品檢測(cè)的色譜峰信噪比高于3和高于10分別確定檢出限和定量限。結(jié)果表明，6種化合物在0.1-100μg/L線性范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，R2>0.99;6種真菌毒素運(yùn)用本方法的檢出限和定量限分別為0.05μg/kg、0.2μg/kg。

2.樣品加標(biāo)回收率。將包含6種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液分別添加至25g谷物和5g肉及肉制品、蛋、乳的樣品中，最終的添加量分別是0.2μg/kg、1.0μg/kg、60.0μg/kg，使用上述方法開展提取和凈化分離以及確證，每個(gè)添加水平進(jìn)行6份樣品的測(cè)定，進(jìn)而得出6種化合物的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果進(jìn)一步表明，在不同添加水平下，化合物均有滿意的回收率及方法重復(fù)性。

本文通過構(gòu)建超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的方法，對(duì)食品中玉米赤霉烯酮類6種真菌毒素進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，經(jīng)免疫親和柱進(jìn)行凈化后，可以有效實(shí)現(xiàn)在谷物制品和肉、蛋、奶等樣品中高效的回收率。同時(shí)，本文提出的方法靈敏度非常高，整體操作非常簡單，具有較高的重復(fù)性，能夠?qū)κ称分械挠衩壮嗝瓜┩愓婢舅剡M(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。

作者簡介：寧陽陽（1986-），男，漢族，遼寧海城人，大學(xué)本科，中級(jí)工程師，研究方向?yàn)榧Z油儲(chǔ)檢。