GSNOR的原核表達(dá)及亞硝基化修飾對其活性的影響

張林林, 韓 毅

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

S-亞硝基谷胱甘肽還原酶(GSNOR)的生物學(xué)研究起源于動(dòng)物和大腸桿菌,從細(xì)菌到人類所有物種中都存在,且保守性高。其最初被認(rèn)定為是一個(gè)依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶,后來發(fā)現(xiàn)其催化反應(yīng)過程包含 S-亞硝基谷胱甘肽羥基的氧化、谷胱甘肽與甲醛成形成 S-甲酰基谷胱甘肽[1]。因此,重新命名為 S-亞硝基谷胱甘肽還原酶,其在植物生長發(fā)育過程中扮演著重要的角色。研究已發(fā)現(xiàn),在番茄中,抑制GSNOR的表達(dá)提高了內(nèi)源的NO和S-亞硝基化水平,導(dǎo)致了發(fā)芽率提高、根和下胚軸生長被抑制、根毛數(shù)量減少,頂端優(yōu)勢被破壞,側(cè)枝生長被促進(jìn)、光合作用降低、果實(shí)結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量低等不良影響[2];在擬南芥中發(fā)現(xiàn)GSNOR基因的突變出現(xiàn)了生長缺陷、植物疾病反應(yīng)受損、熱敏感性等問題[3-4]。因此,研究植物體內(nèi)的GSNOR活性調(diào)節(jié)機(jī)制是十分必要的。

NO作為一種信號分子來調(diào)節(jié)植物中的許多細(xì)胞功能和信號傳導(dǎo),其在植物生長發(fā)育、代謝和脅迫響應(yīng)等的調(diào)節(jié)功能已被廣泛研究。在動(dòng)物中,NO也以信號分子的形式介導(dǎo)神經(jīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等途徑[5-6]。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是NO依賴信號通路的重要特征[7],NO可以通過蛋白翻譯后修飾來影響酶或蛋白質(zhì)的活性和功能。例如蛋白質(zhì)的不可逆硝化和可逆亞硝基化等, NO也可以以離子形式結(jié)合到過渡金屬上,形成金屬-亞硝?；j(luò)合物,稱為金屬亞硝化作用。其中作為亞硝基基團(tuán)(—NO)與半胱氨酸(Cys)硫醇的共價(jià)連接的蛋白質(zhì)S-亞硝化是NO生物學(xué)活性的關(guān)鍵機(jī)制[8-10]。S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)是NO的主要儲存庫和轉(zhuǎn)運(yùn)形式,比NO自由基穩(wěn)定,可將其NO部分轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上,其在植物體內(nèi)的水平由其合成或降解2個(gè)途徑?jīng)Q定。NO及其衍生物活性氮在有氧條件下均能與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化分子谷胱甘肽反應(yīng)形成亞硝基谷胱甘肽(GSNO)。非酶促途徑和酶促途徑是GSNO的2種降解途徑[11],非酶途徑為紫外線、高溫、堿等的破壞,而酶促途徑的關(guān)鍵酶為GSNOR,它不可逆降解GSNO,這一作用對于維持亞硝基化的穩(wěn)態(tài)十分重要。

研究發(fā)現(xiàn),擬南芥GSNOR包含9個(gè)高度保守的非鋅配位半胱氨酸殘基,可發(fā)生S-亞硝化、谷胱甘肽化或可逆氧化等翻譯后修飾,其中Cys10、Cys271、Cys370 共3個(gè)位點(diǎn)被認(rèn)為在GSNOR活性的調(diào)節(jié)中具有保守作用[12]。本文運(yùn)用原核表達(dá)的方法將GSNOR體外表達(dá)并分離出,探索NO能否亞硝基化GSNOR,以及能否通過這種修飾影響GSNOR的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥(哥倫比亞)、PET28a(+)質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α克隆菌株、大腸桿菌BL21表達(dá)菌株。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

反轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、Taq酶、T4DNA連接酶、鎳柱、咪唑、質(zhì)粒提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂粉、酵母提取物、牛肉膏。

1.2 儀器

高溫高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、真空泵等恒溫培養(yǎng)震蕩器、紫外分光光度計(jì)、冷柜等。

1.3 方法

1.3.1 目的基因克隆

從tair網(wǎng)站中搜索目的基因的cDNA序列(GSONR的登錄號為AT5G43940),根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)出引物GSNOR-F和GSNOR-R。

提取野生型擬南芥總RNA,將mRNA反轉(zhuǎn)得到cDNA,以cDNA為模板擴(kuò)增GSNOR基因的全編碼序列(coding sequence,CDS)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的反應(yīng)條件為98 ℃、3 min；98 ℃、10 s;54 ℃、15 s;72 ℃、80 s;72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物和PET28a(+)載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,確定陽性菌落后,提取質(zhì)粒并測序。測序結(jié)果符合已知基因序列,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)感受態(tài)BL21,確認(rèn)陽性菌落,保存甘油菌備用。

1.3.2 蛋白的誘導(dǎo)

將轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21的陽性菌接種在4個(gè)裝有250 mL LB+250 μL kana的培養(yǎng)液中,在220 r/min、37 ℃條件下?lián)u至菌的OD600為0.6,在每個(gè)錐形瓶中加1 mol/L的IPTG 50 μL(終濃度為0.2 mmol/L),22 ℃條件下誘導(dǎo)16～24 h。SDS-PAGE電泳確認(rèn)是否誘導(dǎo)成功。

1.3.3 蛋白的純化

收集菌體沉淀并用溶液Ⅰ(20 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl,pH值為7.6)重懸,細(xì)胞裂解30 min,離心收集上清并抽濾,通過鎳柱純化蛋白,所有上柱的液體都需抽濾。用溶液Ⅰ、30 mL溶液Ⅱ(20 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl 、50 mmol/L咪唑, pH值為7.6)洗脫雜蛋白,用溶液Ⅲ(20 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl 、300 mmol/L咪唑,pH值為7.6)洗脫目的蛋白。利用透析法將咪唑除去,將蛋白保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 蛋白質(zhì)量濃度和酶活的檢測

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,將目的蛋白稀釋合適的倍數(shù)測A595,計(jì)算蛋白質(zhì)量濃度。底物GSNO在利用NADH的條件下能被GSNOR降解,測定NADH在A340的吸光值可計(jì)算出GSNOR的酶活[13]。根據(jù)實(shí)際的蛋白質(zhì)量濃度來決定GSNOR用量。測定buffer(20 mmol/L Tris、0.5 mmol/L EDTA,pH值為8.0)、GSNOR蛋白、20 mmol/L GSNO的總體積為l mL,底物GSNO終濃度為400 μmol/L,檢測2 min。

1.3.5 亞硝基化水平檢測

本文利用生物素轉(zhuǎn)換技術(shù)(biotin switch technique,BST)[14]來檢測GNSOR能否被NO亞硝基化。先通過MMTS封閉巰基(—SH),然后用抗壞血酸將SNO還原為—SH,再用生物素Biotin標(biāo)記—SH。處理的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后,蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上與生物素親和抗體Biotin-HRP孵育。顯影后可觀察到GSNOR蛋白亞硝基化水平。

1.3.6 DEA/NO和DTT處理GSNOR蛋白

1 mmol/L的NO供體2-(N,N-二乙基氨基)-二氮烯-2-氧二乙銨鹽(DEA/NO)和GSNOR蛋白孵育30 min后,一組加20 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)孵育30 min,另一組加緩沖液放置30 min,分別測定未用DEA/NO處理、DEA/NO處理但未加DTT還原及DEA/NO處理后加DTT還原這3組處理后的GSNOR蛋白的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSNOR的PCR擴(kuò)增結(jié)果

本文以擬南芥野生型的cDNA為模板,以GSNOR-F和GSNOR-R為引物進(jìn)行擴(kuò)增,核酸瓊脂糖電泳檢測結(jié)果如圖1所示,由圖1可知，擴(kuò)增產(chǎn)物有一條特異性帶,與擬南芥GSNOR基因的大小相符(GSNOR大小為1 176 bp)。

圖1 PCR擴(kuò)增GSNOR基因片段瓊脂糖電泳圖

2.2 PET28a(+)-GSNOR原核表達(dá)載體的鑒定

提取陽性菌落質(zhì)粒進(jìn)行測序,測序結(jié)果顯示質(zhì)粒中連接的目的基因與GSNOR基因片段完全相符,未發(fā)生任何突變,將送去測序的菌落進(jìn)行擴(kuò)搖,提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21,挑取單克隆進(jìn)行菌落鑒定。以GSNOR-F和GSNOR-R為引物,確認(rèn)GSNOR與載體是否成功連接。菌落PET28a(+)-GSNOR/BL21的PCR電泳圖如圖2所示,圖2中,條帶在1 000 bp稍多的位置,與實(shí)際大小1 176 bp相符,因此可以選取含目的基因的單克隆作為誘導(dǎo)菌種。

圖2 菌落PET28a(+)-GSNOR/BL21 PCR電泳圖

2.3 GSNOR蛋白的誘導(dǎo)結(jié)果

在22 ℃條件下,0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12～16 h,SDS-PAGE電泳檢測誘導(dǎo)產(chǎn)物如圖3所示,圖3中,M代表Marker;1泳道代表未誘導(dǎo)時(shí)大腸桿菌中的蛋白分布;2、3泳道代表誘導(dǎo)后的蛋白分布。由圖3可知,在接近42.7 kDa(GSNOR為42 kDa,6個(gè)組氨酸為0.9 kDa)處,誘導(dǎo)后的2、3泳道與對照1泳道相比明顯增多,表明GSNOR蛋白被成功誘導(dǎo)。

圖3 GSNOR蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳圖

2.4 GSNOR蛋白的純化結(jié)果

誘導(dǎo)的粗蛋白利用鎳柱純化,在蛋白上樣后,帶有His標(biāo)簽的融合蛋白特異性結(jié)合到柱子里,其他的雜蛋白隨之流出。鎳與咪唑發(fā)生競爭性結(jié)合,目的蛋白則被洗脫下來,即GSONR與雜蛋白成功分離,SDS-PAGE電泳檢測不同時(shí)段的洗脫液,電泳圖如圖4所示。

圖4中,M代表Marker;1、2、3泳道代表雜蛋白的洗脫結(jié)果;4、5、6泳道代表目的蛋白的洗脫結(jié)果,4泳道的洗脫液含大量的目的蛋白,利用透析袋將該洗脫液的咪唑脫去后,將目的蛋白置于-80 ℃保存。

圖4 GSNOR蛋白純化SDS-PAGE電泳圖

2.5 GSNOR蛋白的質(zhì)量濃度及酶活檢測結(jié)果

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蛋白質(zhì)量濃度為0.77 μg/μL。以GSNO為底物,NADH為還原力測得酶活約為140 U/mg。蛋白質(zhì)量濃度、純度及活力足以支持下一步實(shí)驗(yàn)。

2.6 亞硝基化水的檢測結(jié)果

為確定NO對GSNOR的修飾是否是亞硝基化修飾,本文利用BST技術(shù)檢測NO處理后的GSNOR的亞硝基化程度和DTT還原NO處理的GSNOR蛋白的亞硝基化程度，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,未用NO處理時(shí)GSNOR蛋白幾乎無亞硝基化,而NO處理后未用DTT還原的GSNOR蛋白發(fā)生了明顯的亞硝基化,加DTT還原后,亞硝基化程度明顯削弱。表明GSNOR在NO處理后經(jīng)過了S-亞硝基化。

圖5 GSNOR的亞硝基化水平分析

2.7 GSNOR蛋白處理后的酶活檢測結(jié)果

DEA/NO和DTT處理 GSNOR后的酶活分析如圖6所示,由圖6可知,1 mmol/L NO供體DEA/NO處理GSNOR后會導(dǎo)致其酶活降低,且還原劑DTT會使GSNOR酶活恢復(fù)。說明NO使得GSNOR發(fā)生了亞硝基化修飾,且這種修飾導(dǎo)致了GSNOR活性下降,還原劑DTT可以還原這種修飾,使酶活恢復(fù)。

圖6 DEA/NO和DTT處理 GSNOR后的酶活分析

3 討論與展望

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物,研究蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)是重中之重,獲得大量純化的蛋白質(zhì)是研究的基礎(chǔ)。許多蛋白翻譯后修飾發(fā)現(xiàn)是通過體外表達(dá)目的蛋白，然后與猜測的物質(zhì)直接反應(yīng)從而確定兩者是否有關(guān)聯(lián),所得到的結(jié)果可為體內(nèi)的研究提供思路。目前有四大蛋白表達(dá)系統(tǒng),分別為哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)、原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)中的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是最常見的，這是由于大腸桿菌遺傳背景清楚、表達(dá)水平高、成本低、操作簡單。原核蛋白表達(dá)是將外源目的基因,通過構(gòu)建表達(dá)載體并導(dǎo)入特定原核生物或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(如大腸桿菌)。表達(dá)載體帶有特定標(biāo)簽蛋白,例如His標(biāo)簽蛋白,由6個(gè)寡聚的組氨酸組成,標(biāo)簽是目的蛋白純化的關(guān)鍵。文中表達(dá)出的GSNOR蛋白酶活約為140 U/mg，質(zhì)量濃度約為0.77 μg/μL。文獻(xiàn)[15]的GSNOR蛋白的酶活僅有100 U/mg[15],此方法可高效表達(dá)出GSNOR蛋白,說明原核表達(dá)載體及相關(guān)條件適合GSNOR蛋白的表達(dá)。蛋白被修飾后,常用質(zhì)譜法鑒定修飾位點(diǎn),樣品所需體積小,同時(shí)對蛋白含量也有較高的要求,高效表達(dá)出高質(zhì)量濃度的蛋白可解決這一問題。

NO的主要作用是對目標(biāo)蛋白的半胱氨酸殘基進(jìn)行亞硝基化的修飾。大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有半胱氨酸,但這種氨基酸殘基與NO的親和力可能有很大的不同。在文中,BST結(jié)果顯示,DEA/NO處理后,GSNOR蛋白發(fā)生了亞硝基化修飾,DTT顯著削弱亞硝基化水平,且GSNOR酶活被NO供體DEA/NO可逆抑制。此外,GSNOR的酶活也可被GSNO抑制,實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)還原劑DTT可降解GSNO,因此選用了DEA/NO作為NO供體。兩者皆可修飾GSNOR,使得GSNOR酶活下降,說明GSNOR的某些半胱氨酸殘基被NO修飾且影響了GSNOR的活性。GSNOR的這種修飾可能代表一種信號,對細(xì)胞內(nèi)的GSNO水平起著調(diào)控作用。GSNOR可降解GSNO,而NO及其衍生物又能修飾GSNOR,由此推測,NO可能通過修飾GSNOR的半胱氨酸影響GSNOR的活性,進(jìn)而影響了GSNO的水平。

4 結(jié) 論

本文建立了體外高效表達(dá)GSNOR的方法,獲得了質(zhì)量濃度約0.77 μg/μL的GSNOR蛋白,并探索亞硝基化修飾對GSNOR酶活的影響,為NO的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及GSNOR的功能和結(jié)構(gòu)的研究提供了思路和基礎(chǔ)。