番茄葉片酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及Pti互作蛋白篩選

王 洋, 王瑩瑩, 張 政, 馮國(guó)棟, 周 宇, 牛向麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

蛋白質(zhì)作為大多數(shù)基因編碼的最終產(chǎn)物,負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)主要生物過(guò)程。它們可以單獨(dú)行使功能,更多的是與其他蛋白質(zhì)通過(guò)相互作用,彼此之間密切協(xié)調(diào)建立復(fù)雜的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),共同維持生物體的正常生命活動(dòng)。因此,蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的闡明是生物學(xué)的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容。目前,蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法有多種,其中20世紀(jì)90年代興起的酵母雙雜交技術(shù),仍是研究蛋白質(zhì)互作的有效手段之一[1]。這種技術(shù)是基于真核生物轉(zhuǎn)錄因子具有2個(gè)可分離的結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(binding domain,BD)和激活結(jié)構(gòu)域(activating domain,AD)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別結(jié)合于特定基因組DNA序列,而激活結(jié)構(gòu)域則促進(jìn)所識(shí)別特定基因的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用,可以使BD、AD結(jié)構(gòu)域接近而激活下游報(bào)告基因的表達(dá)[2],由此利用報(bào)告基因的表達(dá)檢測(cè)與某一蛋白質(zhì)(誘餌)發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)(獵物)[3]。在過(guò)去的幾十年中,酵母雙雜交技術(shù)不僅用于檢測(cè)已知蛋白質(zhì)間的互作,還被應(yīng)用于篩選各種基因文庫(kù),通過(guò)從酵母文庫(kù)中批量篩選獲得與已知蛋白互作的未知蛋白,極大降低了大規(guī)模庫(kù)篩選的成本和人力[4-5],進(jìn)而用于探究蛋白質(zhì)之間的作用網(wǎng)絡(luò)及其所調(diào)控的生命活動(dòng)。

番茄抗病蛋白Pto由抗病基因P.s.pv.tomato編碼,作為識(shí)別、防御病原菌的一種重要抗性蛋白,可以識(shí)別病原菌注入植物體內(nèi)的效應(yīng)蛋白,觸發(fā)下游防御反應(yīng),在番茄的抗病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[6-7]。在之前的研究中,通過(guò)使用酵母雙雜交技術(shù)檢測(cè)到與Pto互作的蛋白質(zhì),并命名為Pti (Pto interaction protein)[8-9]。其中Pti4/5/6編碼蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄因子特性,可以特異結(jié)合于病程相關(guān)PR基因的啟動(dòng)子GCC box元件[10],被認(rèn)為可能做為下游基因參與Pto所介導(dǎo)抗病途徑。有研究表明,Pti4的表達(dá)可以由生物和非生物脅迫引起,受乙烯、水楊酸、創(chuàng)傷和病原菌誘導(dǎo),而Pti5僅由病原微生物,如番茄斑點(diǎn)病致病菌丁香假單胞桿菌番茄致病變種DC3000(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000，PstDC3000)誘導(dǎo)特異表達(dá)[11]。此外,還有報(bào)道認(rèn)為Pti5通過(guò)上調(diào)PR基因使植物表現(xiàn)出對(duì)蚜蟲的抗性[12]。已有報(bào)道均表明,Pti基因可能在番茄防御免疫、生長(zhǎng)發(fā)育等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮作用,然而近年來(lái)對(duì)Pti基因的研究較少,對(duì)植物體內(nèi)Pti的互作蛋白也所知甚少。因此,本文以正常生長(zhǎng)番茄野生型葉片、接種丁香假單胞桿菌番茄致病菌株P(guān)stDC3000的感病株系prf3[13]、抗性株系PtoR[14]的葉片構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù),通過(guò)篩選文庫(kù)Pti5互作蛋白信息,以利于后續(xù)對(duì)Pti作用機(jī)制的深入研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

本研究所用野生型番茄品種AC+、PtoR、prf3來(lái)自于美國(guó)康奈爾大學(xué)THOMPSON植物研究所,由本實(shí)驗(yàn)室繁育保存,種植于合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院的人工氣候培養(yǎng)室。

1.1.2 菌株與載體

丁香假單胞桿菌菌株P(guān)stDC3000,大腸桿菌E.coli菌株DH5α、KC8,酵母菌株EGY48,pEG202、pJG4-5載體。以上菌株和載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑與藥品

質(zhì)粒提取試劑盒、Oligotex mRNA Kit,均購(gòu)于Qiagen;Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶,均購(gòu)于Invitrogen;DNA連接酶購(gòu)于NEB;限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶,均購(gòu)于Takara;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、聚乙二醇3350 (PEG3350)、鮭魚精DNA (carrier DNA),均購(gòu)于Sigma-Aldrich;酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acid)、各種氨基酸,均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;葡萄糖(glucose,Glu)、棉籽糖(raffinose,Raf)、半乳糖(galactose,Gal)、醋酸鋰(LiAc)等均為國(guó)外原裝進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 番茄葉片酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

分別取正常生長(zhǎng)未處理野生型番茄植株葉片、以真空滲透法接種PstDC3000的感病株系prf3及抗性株系PtoR的葉片,液氮研磨提取總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop 2000檢測(cè)所提RNA的質(zhì)量濃度和質(zhì)量。使用Oligotex mRNA Kit試劑盒分離純化mRNA,并按RNA質(zhì)量濃度將不同處理?xiàng)l件的葉片樣品等量混合,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于文庫(kù)構(gòu)建。

參考Clontech公司提供的酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建方法,將合成的雙鏈cDNA加5’接頭,均一化處理后,利用同源重組法將已純化的雙鏈cDNA與酶切后pJG4-5載體連接,連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

取轉(zhuǎn)化菌液10 μL作為母液,稀釋100倍后取出10 μL涂布于氨芐青霉素抗性的培養(yǎng)板。待單克隆長(zhǎng)出后統(tǒng)計(jì)個(gè)數(shù),用于計(jì)算文庫(kù)容量,具體計(jì)算公式為：

文庫(kù)容量=每皿平均克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化體積。

挑取單克隆,依據(jù)載體特異引物(PJG4-5-F:CCAGCCTCTTGCTGAGTGGAGATG、PJG4-5-R:AAGCCGACAACCTTGATTGGAG)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,鑒定陽(yáng)性率及插入片段大小。

1.2.2Pti5酵母雙雜交載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

根據(jù)番茄Pti5基因(U89256)編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物SP5F(TCCCCGCGGATGGTTC CAACTCCTCAAAGT)、SP5R(CATGGGCCC TTAACATCTTGATTCAAATACATCATT),分別引入SacⅡ、ApaⅠ酶切位點(diǎn)。以番茄葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將預(yù)期大小的條帶經(jīng)膠回收后連接于pEG202載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,涂布于固體培養(yǎng)基板,待單克隆長(zhǎng)出后提取質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定、測(cè)序,構(gòu)建pEG202-Pti5釣餌(bait)載體。然后利用PEG/LiAc法將pEG202-Pti5載體轉(zhuǎn)化EGY48酵母感受態(tài),并進(jìn)行PCR菌落鑒定,保存陽(yáng)性轉(zhuǎn)化酵母單克隆。

1.2.3 Pti5互作蛋白的篩選

以帶有pEG202-Pti5質(zhì)粒的酵母細(xì)胞制備感受態(tài)。將制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞、carrier DNA與所構(gòu)建文庫(kù)的質(zhì)粒混合、分裝后,均勻涂布于三缺(-His/-Trp/-Ura)固體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)至單克隆生長(zhǎng)。將菌體用涂布棒刮下、收集,加等量甘油保存。取少量上述轉(zhuǎn)化菌液進(jìn)行培養(yǎng),梯度稀釋后分別涂布于四缺(-His/-Trp/-Ura/-Leu)固體培養(yǎng)基,待單克隆生長(zhǎng)后轉(zhuǎn)移至新的四缺固體培養(yǎng)基,再挑取酵母細(xì)胞單克隆至三缺固體培養(yǎng)基封閉,最后將酵母單克隆轉(zhuǎn)至含X-gal的固體顯色培養(yǎng)基,觀察LacZ及Leu報(bào)告基因的表達(dá)情況,若出現(xiàn)藍(lán)色克隆即為陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)化E.coli菌株 KC8。菌落PCR鑒定為陽(yáng)性克隆用于測(cè)序。將經(jīng)測(cè)序獲得的靶標(biāo)基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄葉片酵母雙雜交cDNA文庫(kù)分析

本文分別提取正常生長(zhǎng)未處理的野生型番茄植株葉片、PstDC3000接種處理的感病株系prf3及抗性株系PtoR的葉片RNA,如圖1所示。瓊脂糖凝膠電泳顯示,RNA條帶清晰,核糖體條帶清晰完整。RNA質(zhì)量濃度均大于280 ng/μL,A260/A280為2.03～2.06,顯示RNA質(zhì)量良好,可用于mRNA分離和反轉(zhuǎn)錄。

圖1 番茄葉片樣品RNA

反轉(zhuǎn)錄雙鏈cDNA加5’接頭、均一化處理后連接pJG4-5載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。取10 μL轉(zhuǎn)化菌液稀釋100倍后取10 μL涂布于帶有氨芐青霉素的培養(yǎng)板。培養(yǎng)皿平均生長(zhǎng)克隆數(shù)為250個(gè),計(jì)算文庫(kù)容量為1.25×107CFU。隨機(jī)挑取24個(gè)克隆,以載體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果顯示均有擴(kuò)增產(chǎn)物,插入片段平均長(zhǎng)度大于1 000 bp。結(jié)果表明,所構(gòu)建番茄葉片酵母雙雜交文庫(kù)質(zhì)量可用于后續(xù)篩選實(shí)驗(yàn)。

2.2 Pti5酵母雙雜交載體構(gòu)建結(jié)果分析

以番茄葉片cDNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增得到483 bp預(yù)期大小的產(chǎn)物,純化后,經(jīng)SacⅡ、ApaⅠ酶切、膠回收,連接于同樣酶切的pEG202載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將轉(zhuǎn)化單克隆提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定、測(cè)序,獲得pEG202-Pti5釣餌載體,如圖2所示。

圖2 pEG202-Pti5載體酶切鑒定

將pEG202-Pti5載體轉(zhuǎn)化酵母菌株感受態(tài)EGY48,對(duì)酵母單克隆進(jìn)行PCR菌落鑒定。陽(yáng)性酵母單克隆于X-gal顯色培養(yǎng)基上劃線28 ℃生長(zhǎng)24 h。酵母克隆呈正常生長(zhǎng)狀態(tài),表明Pti5的轉(zhuǎn)入并未對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒性,也未顯示自激活活性。

2.3 Pti5互作蛋白篩選結(jié)果分析

參照酵母雙雜交文庫(kù)篩選操作步驟,以pEG202-Pti5轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞制備感受態(tài),轉(zhuǎn)入文庫(kù)質(zhì)粒,在培養(yǎng)板上可以看到大量共轉(zhuǎn)化克隆生長(zhǎng),如圖3a所示。

收集共轉(zhuǎn)化克隆涂布至四缺固體培養(yǎng)基,再轉(zhuǎn)移至三缺固體培養(yǎng)基,最后將酵母單克隆移至X-gal顯色培養(yǎng)基,觀察報(bào)告基因的表達(dá)情況。28 ℃培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)有藍(lán)色克隆出現(xiàn),即為陽(yáng)性克隆,如圖3b所示。

圖3 Pti5互作蛋白的篩選

挑取陽(yáng)性克隆于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)、抽提酵母質(zhì)粒,然后將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E.coli菌株 KC8,菌落PCR鑒定后,提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用于PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖4所示。

根據(jù)陽(yáng)性克隆插入片段大小及酶切情況,去除重復(fù)克隆。將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示,初步獲得了3個(gè)可能的靶標(biāo)互作基因:TCP transcription factor (NM-001246881)、serine/threonine-protein kinase BUD32 (NM-001328538)和RNA-binding protein(XM-004242427)。

圖4 陽(yáng)性克隆PCR鑒定

3 討 論

植物抗蟲、抗病基因及其作用機(jī)制一直是植物功能基因研究及遺傳改良的重要問(wèn)題。番茄作為我國(guó)廣泛栽培的一類果蔬類經(jīng)濟(jì)作物,其營(yíng)養(yǎng)豐富,又是目前研究細(xì)菌性病害的一種常見(jiàn)模式植物[15]。

番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病是由丁香假單胞菌引起的病害,在世界范圍內(nèi)均有發(fā)病報(bào)道,病害發(fā)生后會(huì)降低番茄產(chǎn)量、影響其口味[16-17]。番茄抗病基因Pto最早通過(guò)圖位克隆從抗病品種中獲得[18],在番茄的抗病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Pti作為Pto的互作蛋白,與Pto的互作已經(jīng)在植物表達(dá)系統(tǒng)中被驗(yàn)證[19],但對(duì)Pti基因的下游互作蛋白及其可能的作用機(jī)制仍缺乏深入了解。因此,本研究使用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)一步篩選與Pti5相互作用的蛋白質(zhì),以探討Pti在番茄免疫防御中的作用途徑。

通過(guò)選擇不同組織、不同發(fā)育階段以及不同條件處理的生物材料,提取RNA由反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,形成特定條件下功能基因克隆的集合,用于構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫(kù),是篩選互作蛋白的前提和保障[20-22]。本研究基于Pti基因在番茄抗病防御方面的功能,選取不同處理?xiàng)l件下、不同抗病、感病植株樣品用于構(gòu)建cDNA文庫(kù),以盡量使文庫(kù)包含抗病途徑中的相關(guān)基因。經(jīng)檢測(cè)該文庫(kù)容量、插入片段大小及陽(yáng)性率均符合文庫(kù)要求,可用于Pti及其他抗病基因互作蛋白的篩選與后續(xù)機(jī)制研究。

本文在文庫(kù)構(gòu)建基礎(chǔ)上進(jìn)一步以Pti5為誘餌蛋白進(jìn)行了互作蛋白篩選,初步獲得了3個(gè)可能與Pti5互作的轉(zhuǎn)錄因子。Pti5是一個(gè)約20 kDa的小分子量蛋白,它很有可能通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體而對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。經(jīng)過(guò)比對(duì)分析,靶標(biāo)互作基因TCP transcription factor (NM-001246881)編碼TCP轉(zhuǎn)錄因子,該轉(zhuǎn)錄因子家族為植物所特有,位于植物各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的樞紐[23],調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)各種環(huán)境脅迫;serine/threonine-protein kinase BUD32 (NM-001328538) 編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可能參與植物體響應(yīng)脅迫信號(hào)[24];RNA-binding protein (XM-004242427)則編碼RNA結(jié)合蛋白,該類蛋白在基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮功能,被認(rèn)為介導(dǎo)植物對(duì)生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等激素有一定的敏感性,并參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[25]。這些轉(zhuǎn)錄因子涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境脅迫應(yīng)答等調(diào)控途徑,也與所推測(cè)Pti5在番茄中作用機(jī)制相吻合。這些篩選靶標(biāo)蛋白是否在植物體內(nèi)與Pti5相互作用,仍需要后續(xù)在植物表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,由于Pti4/5/6基因具有功能機(jī)制的相似性,本文也為其他Pti基因作用機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)。