香芹酚通過增強(qiáng)PTEN誘導(dǎo)激酶1/Parkin介導(dǎo)的自噬而減輕心肌缺血再灌注損傷的動物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

閆莉，楊光，程功

缺血性心臟病是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共健康問題，其發(fā)病率和死亡率均較高［1］。及時有效的心肌再灌注是挽救缺血心肌細(xì)胞、限制梗死面積的關(guān)鍵。然而，血流的突然恢復(fù)往往會加重缺血心肌的功能損傷，導(dǎo)致一系列不良后果，包括心肌細(xì)胞凋亡和壞死、心律失常和心臟收縮功能障礙，最終導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）［2］。雖然MIRI的病理機(jī)制尚未完全闡明，但已有報道認(rèn)為MIRI與線粒體功能障礙引起的鈣離子超載、活性氧（reactive oxygen species，ROS）積聚、三磷 腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成減少和線粒體膜電位（mitochondrial membrane protential，MMP）降低密切相關(guān)［3］。

自噬是一種高度保守的溶酶體相關(guān)的降解過程，主要負(fù)責(zé)大蛋白聚集體和受損細(xì)胞器的降解，廣泛參與包括心血管疾病在內(nèi)的病理生理過程［4］。自噬如何選擇性地識別和清除受損的線粒體已成為最近研究的一個主要焦點(diǎn)。研究表明，在心血管疾病中，PTEN誘導(dǎo)激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）/Parkin 介導(dǎo)的自噬通過有效地清除受損的線粒體和過量的ROS來維持細(xì)胞內(nèi)線粒體的動態(tài)平衡［5］。PINK1/Parkin介導(dǎo)的自噬可以保護(hù)H9C2心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷［6］。因此，自噬調(diào)控被認(rèn)為是治療MIRI的有效策略。

香芹酚屬于唇形科植物中的單萜酚類，在過去其作為食品添加劑被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)［7］。一些研究表明，香芹酚具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和抗微生物作用［8-10］。另外，有學(xué)者報道香芹酚可通過減輕氧化應(yīng)激及減少心肌細(xì)胞凋亡［11］、減輕線粒體損傷［12］來緩解MIRI。然而，目前尚不清楚香芹酚對MIRI中自噬的影響。本研究旨在通過動物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討香芹酚治療MIRI的效果及其作用機(jī)制，從而為MIRI的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時間 2020年5月至2021年5月。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 香芹酚購自美國Sigma-Aldrich公司；心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）ELISA試劑盒購自上海心語生物科技有限公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）ELISA試劑盒購自無錫云萃生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）ELISA試劑盒購自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自北京索萊寶科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒、BCA蛋白分析試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Masson三色染色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；10%胎牛血清、Lipofectamine 3000購自美國Invitgen公司；青霉素、鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；TUNEL染色試劑盒購自美國羅氏公司；RIPA裂解緩沖液購自北京凱瑞基生物科技有限公司；PINK1、Parkin、Beclin1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein 3，LC3）和抗β-actin試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G購自英國Abcam公司；靶向PINK1的小干擾RNA（small interfering RNA targeting PINK1，PINK1-siRNA）和陰性對照小干擾RNA（negative control siRNA，NC-siRNA）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物和分組 成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只〔平均體質(zhì)量（230±20）g〕，購自南通特洛菲飼料科技有限公司。大鼠飼養(yǎng)在濕度為40%～50%、溫度為25 ℃、光照/黑暗周期為12 h的實(shí)驗(yàn)室中。大鼠可自由獲取食物和水。將大鼠隨機(jī)分為Sham組（A組）、MIRI組（B組）、MIRI+20 mg/kg香芹酚組（C組）和MIRI+60 mg/kg香芹酚組（D組），每組12只。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和分組 大鼠心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞購自美國ATCC。將H9C2細(xì)胞分為對照組（E組）、H/R組（F組）、H/R+香芹酚組（G組）、H/R+香芹酚+NC-siRNA組（H組）和H/R+香芹酚+PINK1-siRNA組（I組）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動物實(shí)驗(yàn)

1.5.1.1 MIRI模型的建立 B、C、D組大鼠腹腔注射5%水合氯醛（0.01 ml/g）麻醉后，連接動物呼吸機(jī)，潮氣量2.0～2.5 ml，呼吸頻率為120次/min，而后開胸暴露大鼠心臟。結(jié)扎冠狀動脈左前降支造成心肌缺血。心肌缺血的標(biāo)準(zhǔn)是心電圖上ST段抬高0.2 mV和心臟局部發(fā)紫。心肌缺血30 min后，解除結(jié)扎恢復(fù)血流2 h進(jìn)行再灌注。A組大鼠接受相同的手術(shù)，但不結(jié)扎冠狀動脈左前降支。術(shù)前15 min，C組和D組大鼠腹腔注射相應(yīng)劑量的香芹酚，A組和B組大鼠給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.5.1.2 血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平測定再灌注結(jié)束后，采集大鼠下腔靜脈血，1 000 r/min離心15 min（離心半徑15 cm），收集血清。分別用相應(yīng)的ELISA試劑盒按照制造商的方案測定大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平。

1.5.1.3 心肌梗死面積測定 再灌注結(jié)束后，通過TTC染色確定心肌梗死面積。將大鼠左心室切成2～3 mm的切片，放入含有1% TTC的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）中，于37 ℃避光孵育30 min。正常心肌為紅色，梗死心肌為灰白色。分別用電子天平稱重梗死區(qū)和左心室重量，梗死面積為梗死區(qū)重量占左心室重量的百分比。

1.5.1.4 心肌病變測定 （1）HE染色：將各組大鼠心臟在4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，按照HE染色試劑盒說明書進(jìn)行HE染色，觀察心肌組織形態(tài)。（2）Masson三色染色：將各組大鼠心臟置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，按照Masson三色染色試劑盒說明書進(jìn)行Masson三色染色，觀察心肌纖維化情況，使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算心肌纖維化百分比。（3）TUNEL染色：將各組大鼠心臟置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片；將心肌切片脫蠟和水化后，置于蛋白酶K溶液中，并于37 ℃避光孵育30 min，然后將切片置于TUNEL工作液中于37 ℃孵育60 min；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌并風(fēng)干后，滴加含有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的抗淬滅熒光封固劑封固，置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長范圍為450～500 nm，發(fā)射波長為515～565 nm。計(jì)算心肌組織TUNEL陽性率。

1.5.1.5 心肌組織中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ檢測 采用Western blot法檢測心肌組織中PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表達(dá)水平，具體方法如下：使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液從心肌組織中分離蛋白，采用BCA蛋白分析試劑盒測定總蛋白濃度。采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離50 μg蛋白并電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。采用5%脫脂牛奶封閉后，將切片置于抗PINK1、Parkin、Beclin1、LC3、β-actin（均為1∶1 000稀釋）中，于4 ℃孵育過夜。然后在室溫下于辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（1∶2 000稀釋）中孵育1 h。以β-actin作為內(nèi)參。通過Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，并用Image J軟件計(jì)算PINK1、Parkin、Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白條帶的灰度值，并計(jì)算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ。

1.5.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.5.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方法 將H9C2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。取各組對數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞，E組在正常環(huán)境（37 ℃、5% CO2、95%空氣）中于完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；F組在37 ℃、5% CO2、95% N2的環(huán)境中于無糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行缺氧處理4 h后將細(xì)胞在正常環(huán)境中于完全DMEM培養(yǎng)基中復(fù)氧培養(yǎng)；G組用香芹酚（100 μmol/L）預(yù)處理6 h后，采用與F組相同的方法進(jìn)行H/R處理；H組和I組在轉(zhuǎn)染NC-siRNA或PINK1-siRNA后，分別用香芹酚（100 μmol/L）預(yù)處理6 h，然后進(jìn)行H/R處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法如下：將H9C2細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種于6孔板上，使用Lipofectamine 3000將PINK1-siRNA或NC-siRNA轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染方法按照說明書進(jìn)行操作。

1.5.2.2 細(xì)胞活力檢測 采用MTT法檢測細(xì)胞活力，具體方法如下：H/R處理完成后，向各培養(yǎng)孔中加入50 μl MTT溶液，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 h。然后將培養(yǎng)板以2 500 r/min離心5 min（離心半徑15 cm），棄去上清液，各孔加入150 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。振蕩30 s，用酶標(biāo)儀測量550 nm處吸光度值并計(jì)算細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.5.2.3 細(xì)胞凋亡率檢測 采用TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡率，具體方法如下：將H9C2細(xì)胞以2×104個/孔的密度接種到24孔板中，采用4%多聚甲醛室溫固定30 min，采用0.1% Triton X-100在0.1%枸櫞酸鈉中滲透H9C2細(xì)胞2 min。PBS洗滌后，將細(xì)胞與TUNEL反應(yīng)混合物在37 ℃下孵育1 h，然后用DAPI染核，采用熒光顯微鏡觀察染色的細(xì)胞。隨機(jī)選擇6個高倍視野，計(jì)數(shù)每個視野中的總細(xì)胞數(shù)和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)（綠色熒光），之后計(jì)算TUNEL陽性率，即細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.5.2.4 H9C2細(xì)胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ檢測 采用Western blot法檢測H9C2細(xì)胞中Beclin1、LC3、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平，方法同1.5.1.5。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平 A、B、C、D組大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B、C、D組大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C、D組大鼠血清cTnI、CKMB、AST、LDH水平低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 A、B、C、D組大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平比較（±s，n=12）Table 1 Comparison of serum levels of cTnI，CK-MB，AST and LDH of rats in groups A，B，C and D

表1 A、B、C、D組大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平比較（±s，n=12）Table 1 Comparison of serum levels of cTnI，CK-MB，AST and LDH of rats in groups A，B，C and D

注：A組為Sham組，B組為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）組，C組為MIRI+20 mg/kg香芹酚組，D組為MIRI+60 mg/kg香芹酚組；a表示與A組比較，P＜0.05；b表示與B組比較，P＜0.05；c表示與C組比較，P＜0.05；cTnI=心肌肌鈣蛋白I，CK-MB=肌酸激酶同工酶，AST=天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，LDH=乳酸脫氫酶

組別 cTnI（μg/L） CK-MB（U/L） AST（U/L） LDH（U/L）A組 212.54±27.63 98.57±12.81 227.88±29.62 219.43±28.53 B 組 417.478±54.27a 378.49±49.20a 677.43±88.07a 897.53±116.68a C 組 331.36±43.08ab 219.65±28.55ab 388.49±50.50ab 455.32±59.19ab D組 278.35±36.19abc 175.35±22.80abc 316.32±41.12abc 279.09±36.28abc F值 26.190 85.402 70.651 117.200 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 心肌梗死面積 A、B、C、D組大鼠心肌梗死面 積 分 別 為 0、21.35%±2.60%、13.14%±1.60%、7.54%±0.92%。B、C、D組大鼠心肌梗死面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=170.845，P＜0.001）。C、D組大鼠心肌梗死面積小于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組大鼠心肌梗死面積小于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 A、B、C、D組大鼠心肌組織TTC染色結(jié)果（×10）Figure 1 TTC staining results of myocardial tissue of rats in groups A，B，C and D

2.3 心肌病變 HE染色結(jié)果顯示，A組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核明顯，無炎性細(xì)胞浸潤；B組大鼠心肌組織廣泛壞死，心肌纖維排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤；C、D組大鼠心肌細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞壞死程度和范圍明顯減輕，見圖2。

圖2 A、B、C、D組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果（×200）Figure 2 HE staining result of myocardial tissue of rats in groups A，B，C and D

Masson三色染色結(jié)果顯示，A組大鼠心肌組織以心肌細(xì)胞為主，沒有明顯的膠原成分；B組大鼠心肌組織心肌纖維化明顯，僅有少量心肌細(xì)胞存在；C、D組大鼠心肌組織的膠原纖維含量明顯減少，見圖3。定量分析結(jié)果顯示，A、B、C、D組大鼠心肌纖維化百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B、C、D組大鼠心肌纖維化百分比高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C、D組大鼠心肌纖維化百分比低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組大鼠心肌纖維化百分比低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖3。

圖3 A、B、C、D組大鼠心肌組織Masson三色染色結(jié)果（×400）Figure 3 Masson trichrome staining result of myocardial tissue of rats in groups A，B，C and D

TUNEL染色結(jié)果顯示，A、B、C、D組大鼠心肌組織TUNEL陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B、C、D組大鼠心肌組織TUNEL陽性率高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C、D組大鼠心肌組織TUNEL陽性率低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組大鼠心肌組織TUNEL陽性率低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖4。

圖4 A、B、C、D組大鼠心肌組織TUNEL染色結(jié)果（×200）Figure 4 TUNEL staining result of myocardial tissue of rats in groups A，B，C and D

表2 A、B、C、D組大鼠心肌纖維化百分比、心肌組織TUNEL陽性率比較（± s，%，n=12）Table 2 Comparison of rat myocardial fibrosis rate and myocardial tissue TUNEL positive rate in groups A，B，C and D

表2 A、B、C、D組大鼠心肌纖維化百分比、心肌組織TUNEL陽性率比較（± s，%，n=12）Table 2 Comparison of rat myocardial fibrosis rate and myocardial tissue TUNEL positive rate in groups A，B，C and D

注：a表示與A組比較，P＜0.05；b表示與B組比較，P＜0.05；c表示與C組比較，P＜0.05

組別 心肌纖維化百分比 心肌組織TUNEL陽性率A組 0.54±0.07 0.27±0.03 B組 61.43±7.49a 22.43±2.74a C組 32.56±3.97ab 6.75±0.82ab D組 20.65±2.52abc 2.21±0.27abc F值 198.803 293.712 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.4 心肌組織中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ A、B、C、D組大鼠心肌組織中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B、C、D組大鼠心肌組織中PINK1、Beclin1蛋白表達(dá)水平低于A組，B、C組大鼠心肌組織中Parkin蛋白表達(dá)水平低于A組，B組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于A組，C、D組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C、D組大鼠心肌組織中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組大鼠心肌組織中Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3、圖5。

圖5 Western blot檢測A、B、C、D組大鼠心肌組織中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的SDS-PAGE圖Figure 5 SDS-PAGE images of PINK1，Parkin，Beclin1 protein expression level and LC3-Ⅱ /LC3-Ⅰ detected by Western blot in myocardial tissues of rats in groups A，B，C，D

表3 A、B、C、D組大鼠心肌組織中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較（± s，n=12）Table 3 Comparison of expression levels of PINK1，Parkin and Beclin1 protein and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in the myocardial tissues of rats in groups A，B，C and D

表3 A、B、C、D組大鼠心肌組織中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較（± s，n=12）Table 3 Comparison of expression levels of PINK1，Parkin and Beclin1 protein and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in the myocardial tissues of rats in groups A，B，C and D

注：a表示與A組比較，P＜0.05；b表示與B組比較，P＜0.05；c表示與C組比較，P＜0.05；PINK1=PTEN誘導(dǎo)激酶1，LC3=微管相關(guān)蛋白輕鏈3

images/BZ_79_1275_2631_2277_2689.pngA 組 1.00±0.14 1.00±0.12 1.00±0.09 1.00±0.08 B 組 0.23±0.02a 0.24±0.03a 0.18±0.03a 0.24±0.04a C 組 0.76±0.11ab 0.86±0.11ab 0.57±0.09ab 1.26±0.17ab D 組 0.83±0.08ab 0.97±0.08bc 0.70±0.02abc 1.35±0.14ab F值 68.982 101.655 156.986 106.612 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 細(xì)胞活力 E、F、G、H、I組細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。F、G、H、I組細(xì)胞活力小于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；G、H組細(xì)胞活力大于F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；I組細(xì)胞活力小于G、H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖6。

圖6 MTT法檢測E、F、G、H、I組細(xì)胞活力結(jié)果（×400）Figure 6 Cell viability results of groups of E，F(xiàn)，G，H，I detected by MTT method

2.6 細(xì)胞凋亡率 E、F、G、H、I組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。F、G、H、I組細(xì)胞凋亡率高于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；G、H、I組細(xì)胞凋亡率低于F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；I組細(xì)胞凋亡率高于G、H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 E、F、G、H、I組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=6）Table 4 Comparison of cell viability and apoptosis rate in groups E，F(xiàn)，G，H，I

表4 E、F、G、H、I組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=6）Table 4 Comparison of cell viability and apoptosis rate in groups E，F(xiàn)，G，H，I

注：E組為對照組，F(xiàn)組為缺氧/復(fù)氧（H/R）組，G組為H/R+香芹酚組，H組為H/R+香芹酚+陰性對照小干擾RNA（NC-siRNA）組，I組為H/R+香芹酚+靶向PINK1的小干擾RNA（PINK1-siRNA）組；a表示與E組比較，P＜0.05；b表示與F組比較，P＜0.05；c表示與G組比較，P＜0.05；d表示與H組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞活力 細(xì)胞凋亡率（%）E 組 1.00±0.15 2.06±0.10 F 組 0.50±0.08a 31.94±3.68a G 組 0.77±0.11ab 7.36±0.93ab H 組 0.72±0.12ab 8.50±0.81ab I組 0.53±0.04acd 16.34±1.87abcd F值 21.557 218.452 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.7 H9C2細(xì)胞中 PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ E、F、G、H、I組H9C2細(xì)胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。F組H9C2細(xì)胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；G、H組H9C2細(xì)胞中PINK1、Beclin1蛋白表達(dá)水平低于E組、高于F組，Parkin蛋白表達(dá)水平高于F組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于E、F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；I組H9C2細(xì)胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于E、G、H組，Beclin1蛋白表達(dá)水平高于F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5、圖7。

圖 7 Western blot檢 測 E、F、G、H、I組 H9C2細(xì) 胞 中 PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的SDS-PAGE圖Figure 7 SDS-PAGE images of PINK1，Parkin，Beclin1 protein expression level and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in H9C2 cells in groups E，F(xiàn)，G，H，I detected by Western blot

表5 E、F、G、H、I組H9C2細(xì)胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較（± s，n=6）Table 5 Comparison of PINK1，Parkin，Beclin1 protein expression level and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in H9C2 cells in groups E，F(xiàn)，G，H，I

表5 E、F、G、H、I組H9C2細(xì)胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較（± s，n=6）Table 5 Comparison of PINK1，Parkin，Beclin1 protein expression level and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in H9C2 cells in groups E，F(xiàn)，G，H，I

注：a表示與E組比較，P＜0.05；b表示與F組比較，P＜0.05；c表示與G組比較，P＜0.05；d表示與H組比較，P＜0.05

組別 PINK1蛋白 Parkin蛋白 Beclin1蛋白 LC3-Ⅱ/LC3-ⅠE 組 1.00±0.07 1.00±0.04 1.00±0.12 1.00±0.14 F組 0.19±0.01a 0.25±0.02a 0.24±0.03a 0.65±0.08a G 組 0.85±0.07ab 1.01±0.12b 0.75±0.09ab 1.34±0.16ab H 組 0.89±0.11ab 0.99±0.16b 0.71±0.09ab 1.38±0.17ab I組 0.14±0.03acd 0.22±0.03acd 0.36±0.04abcd 0.67±0.08acd F值 222.636 118.251 83.557 48.775 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

香芹酚是一種單萜酚類化合物，具有廣泛的生物活性，包括抗菌［13］、抗病毒［14］、抗氧化［15］、改善免疫反應(yīng)［16］等。香芹酚由于具有調(diào)味功能和抗菌活性已被用作食品工業(yè)的天然食品防腐劑［17］。此外，已有研究報道，香芹酚在MIRI的預(yù)防方面具有重要作用，然而尚不清楚其主要藥理學(xué)機(jī)制。因此，本研究深入考察了香芹酚防治MIRI的可能分子機(jī)制。

血清cTnI、CK-MB、AST、LDH是診斷心肌損傷的常見標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，C、D組大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平低于B組；D組大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平低于C組，提示香芹酚以劑量依賴性方式減輕了MIRI大鼠的心肌損傷。C、D組大鼠心肌梗死面積小于B組，D組大鼠心肌梗死面積小于C組。此外，HE染色結(jié)果顯示，B組大鼠心肌組織廣泛壞死，心肌纖維排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤；C、D組大鼠心肌細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞壞死程度和范圍明顯減輕。Masson三色染色結(jié)果顯示，C、D組大鼠心肌纖維化百分比低于B組；D組大鼠心肌纖維化百分比低于C組。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)香芹酚以劑量依賴性方式減輕了MIRI大鼠的心肌損傷及纖維化程度。

本研究TUNEL染色結(jié)果顯示，B、C、D組大鼠心肌組織TUNEL陽性率高于A組；C、D組大鼠心肌組織TUNEL陽性率低于B組；D組大鼠心肌組織TUNEL陽性率低于C組；提示香芹酚以劑量依賴性方式減輕了MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡。已知細(xì)胞凋亡是心臟疾病發(fā)展過程中細(xì)胞死亡的主要形式之一，并且心肌細(xì)胞凋亡也是MIRI的重要決定因素［18］。因此，減少細(xì)胞凋亡是預(yù)防MIRI的主要措施。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)、G、H、I組細(xì)胞活力小于E組，G、H組細(xì)胞活力大于F組，I組細(xì)胞活力小于G、H組；F、G、H、I組細(xì)胞凋亡率高于E組，G、H、I組細(xì)胞凋亡率低于F組，I組細(xì)胞凋亡率高于G、H組；提示香芹酚通過抑制MIRI大鼠心肌細(xì)胞的凋亡來保護(hù)心肌結(jié)構(gòu)。宋旭東等［11］研究顯示，香芹酚預(yù)處理可減輕MIRI小鼠的氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡。王先寶等［12］研究顯示，香芹酚預(yù)處理可減輕MIRI小鼠的線粒體損傷，從而減小心肌梗死面積。因此，推測香芹酚減輕心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與改善動物體內(nèi)氧化-抗氧化平衡有關(guān)。

越來越多的證據(jù)表明，自噬是MIRI期間心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素［19］。通過PINK1/Parkin途徑上調(diào)自噬可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受MIRI［20］。本研究推測香芹酚的心肌保護(hù)作用可能與自噬和PINK1/Parkin通路有關(guān)。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，本研究檢測了PINK1/Parkin通路及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，B、C、D組大鼠心肌組織中PINK1、Beclin1蛋白表達(dá)水平低于A組，B、C組大鼠心肌組織中Parkin蛋白表達(dá)水平低于A組，B組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于A組，C、D組大鼠心肌組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于A組；C、D組大鼠心肌組織中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于B組；D組大鼠心肌組織中Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平高于C組；F組H9C2細(xì)胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于E組；G、H組H9C2細(xì)胞中PINK1、Beclin1蛋白表達(dá)水平低于E組、高于F組，Parkin蛋白表達(dá)水平高于F組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于E、F組；表明香芹酚上調(diào)了MIRI大鼠心肌組織及H/R處理的H9C2細(xì)胞中PINK1、Parkin、Beclin-1蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，提示香芹酚激活了PINK1/Parkin信號通路并增強(qiáng)了自噬能力。自噬是一個涉及清除受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的降解過程，這個過程有助于維持心肌功能。據(jù)報道，抑制自噬可加重MIRI［21］。研究顯示，PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在心血管疾病中通過有效地清除受損的線粒體和過量的ROS來確保細(xì)胞內(nèi)線粒體的穩(wěn)定性［5］。PINK1/Parkin可檢測到伴有功能障礙的線粒體并招募自噬小體對其進(jìn)行降解［22］。研究表明，PINK1/Parkin誘導(dǎo)的自噬調(diào)節(jié)了心肌細(xì)胞中線粒體的動力學(xué)和功能［23］。隨著年齡增長，Parkin的缺失導(dǎo)致心肌細(xì)胞中的線粒體功能發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激和線粒體呼吸功能障礙［24］。本研究結(jié)果顯示，I組H9C2細(xì)胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于E、G、H組，Beclin1蛋白表達(dá)水平高于F組，提示轉(zhuǎn)染PINK1-siRNA后H9C2細(xì)胞中PINK1蛋白表達(dá)被抑制，并且也逆轉(zhuǎn)了香芹酚對自噬的上調(diào)作用和對PINK1/Parkin通路的激活作用。這些結(jié)果說明，激活PINK1/Parkin通路促進(jìn)自噬是香芹酚抗MIRI的主要機(jī)制。

本研究尚存在一定局限性：（1）雖然本研究使用了兩種劑量的香芹酚來治療MIRI大鼠，然而其最佳使用劑量尚未確定，需要在接下來的研究中進(jìn)一步揭示；（2）參與調(diào)節(jié)MIRI發(fā)生發(fā)展的信號通路非常多，并且自噬也受多種信號通路直接或間接調(diào)節(jié)，因此，PINK1/Parkin介導(dǎo)的自噬通路僅是香芹酚防治MIRI的主要機(jī)制之一，還需要進(jìn)一步研究香芹酚對其他通路的影響；（3）本研究動物實(shí)驗(yàn)中，香芹酚為預(yù)處理給藥，因此，需要在今后的研究中探討后處理給藥方式是否對MIRI大鼠具有相同的治療效果。

綜上所述，動物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均表明，香芹酚通過激活PINK1/Parkin通路增強(qiáng)自噬，從而減輕MIRI，香芹酚在防治MIRI中具有多種機(jī)制，有望成為缺血性心臟病的潛在治療藥物。

作者貢獻(xiàn)：閆莉進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、研究的實(shí)施與可行性分析，撰寫論文；閆莉、楊光進(jìn)行數(shù)據(jù)收集與整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、結(jié)果的分析與解釋；程功進(jìn)行論文的修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。