葉菌唑的液相色譜手性分離分析方法研究

韋紅慧，楊寶萍，韋元杰，李曉昀

(廣西速竟科技有限公司，廣西南寧 530007)

葉菌唑英文名稱：metconazole，CAS號(hào)：125116-23-6，分子式：C17H22ClN3O，化學(xué)名稱：5-(4-氯苯基)-2,2-二甲基-1-(1,2,4-三唑-1-基甲基)-環(huán)戊醇[1]。葉菌唑?yàn)槿毡娟挥鸹瘜W(xué)公司于20世紀(jì)90年代開(kāi)發(fā)的新型三唑類殺菌劑，是一種兼具內(nèi)吸、保護(hù)及治療作用的廣譜殺菌劑[1]。田間施用對(duì)谷物殼針孢、鏈孢霉和柄銹菌引起的病害有卓越效果，對(duì)非靶標(biāo)生物低毒，用量少，殺菌活性高，對(duì)環(huán)境安全，具有良好的發(fā)展前景[1]。

目前報(bào)道葉菌唑的分析方法多為4個(gè)異構(gòu)體未進(jìn)行拆分的檢測(cè)方法[1-2]，即使有報(bào)道手性分離方法，也不是針對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)品[3]?；诖?，本研究采用液相色譜技術(shù)開(kāi)展了8%葉菌唑懸浮劑及50%葉菌唑水分散粒劑的分析研究以期為該藥劑產(chǎn)品質(zhì)量控制及異構(gòu)體拆分提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品

8%葉菌唑懸浮劑和50%葉菌唑水分散粒劑，由廣西田園生化股份有限公司提供。

1.2 試劑和溶液

正己烷，色譜純；無(wú)水乙醇，色譜純；甲醇，色譜純；葉菌唑標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司提供。

1.3 儀器設(shè)備

1260高效液相色譜儀，具有二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器和色譜工作站(美國(guó)安捷倫公司)；色譜柱：250 mm×4.6 mm (i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝CHIRALCEL OJ-H、5 μm填充物。

1.4 高效液相色譜分析條件

流動(dòng)相：正己烷+無(wú)水乙醇+甲醇=981∶15∶4 (體積比)；速流：1.5 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。在此色譜條件下，葉菌唑的保留時(shí)間：1R,5S-葉菌唑約22.6 min，1S, 5R-葉菌唑約24.8 min，1S,5S-葉菌唑約27.4 min，1R,5R-葉菌唑約32.7 min。葉菌唑標(biāo)樣及樣品的典型液相色譜圖見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

1.5 測(cè)定步驟

1.5.1 標(biāo)樣溶液的制備

稱取50.0 mg (精確至0.1 mg)葉菌唑標(biāo)樣于50 mL容量瓶中，加入20 mL流動(dòng)相，超聲波振蕩15 min，冷卻至室溫，用流動(dòng)相定容，搖勻。

1.5.2 試樣溶液的制備

稱取含50.0 mg (精確至0.1 mg)葉菌唑的試樣于50 mL容量瓶中，加入20 mL流動(dòng)相，超聲波振蕩 15 min，冷卻至室溫，用流動(dòng)相定容，搖勻，過(guò)濾。

1.5.3 測(cè)定

在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針葉菌唑(4個(gè)峰總和)峰面積相對(duì)變化小于1.2%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

1.5.4 計(jì)算

將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中葉菌唑(4個(gè)峰總和)峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中葉菌唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)，按公式(1)計(jì)算：

式中：A1為標(biāo)樣溶液中葉菌唑(4個(gè)峰總和)峰面積的平均值；A2為試樣溶液中葉菌唑(4個(gè)峰總和)峰面積的平均值；m1為葉菌唑標(biāo)樣的質(zhì)量，單位為克(g)；m2為試樣的質(zhì)量，單位為克(g)；ω1為標(biāo)樣中葉菌唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以%表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

葉菌唑的紫外掃描光譜圖如圖4所示，從圖4可以看到葉菌唑的最大吸收波長(zhǎng)約220 nm，在該波長(zhǎng)處?kù)`敏度較高，干擾較少，能夠滿足分析的要求，故將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為220 nm。

色譜柱選擇常用的CHIRALCEL OJ-H手性正相柱。根據(jù)葉菌唑物化性質(zhì)和溶劑的紫外吸收波長(zhǎng)，選擇流動(dòng)相作為溶劑溶解樣品。先以正己烷和無(wú)水乙醇作為流動(dòng)相。將流動(dòng)相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，隨著無(wú)水乙醇比例的增加，保留時(shí)間減小，當(dāng)正己烷與無(wú)水乙醇比例達(dá)到985∶15時(shí)，葉菌唑無(wú)雜質(zhì)峰干擾，各個(gè)葉菌唑異構(gòu)體能分離，峰純度達(dá)到試驗(yàn)要求，但分析時(shí)間很長(zhǎng)。故在上述的流動(dòng)相中加少量的甲醇，并調(diào)快流速，在葉菌唑能完全分離的情況下達(dá)到減短分析時(shí)間的效果。最終選擇正己烷+無(wú)水乙醇+甲醇=981∶15∶4作為流動(dòng)相，流速1.5 mL/min。在該條件下，葉菌唑色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時(shí)間較短，提高了工作效率。

2.2 特異性試驗(yàn)

本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度分析法來(lái)鑒別葉菌唑。葉菌唑標(biāo)樣、8%葉菌唑懸浮劑和50%葉菌唑水分散粒劑中的葉菌唑HPLC-DAD峰純度均大于990，有效成分處無(wú)其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。峰純度色譜圖見(jiàn)圖5～圖7。

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

按1.5.1節(jié)分別配制5個(gè)不同質(zhì)量濃度的葉菌唑標(biāo)樣溶液，在相應(yīng)色譜操作條件下進(jìn)行分析，以葉菌唑質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)。當(dāng)葉菌唑質(zhì)量濃度在208.9～3 025.6 mg/L得到線性方程為y=14.17x-63.09，線性相關(guān)系數(shù)R=1.00。

2.4 方法精密度試驗(yàn)

按1.5.2節(jié)試樣溶液的制備方法分別配制5個(gè)8%葉菌唑懸浮劑和5個(gè)50%水分散粒劑溶液。以線性關(guān)系試驗(yàn)中1 009.2 mg/L葉菌唑溶液為標(biāo)樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后進(jìn)行測(cè)定(表1和表2)。測(cè)得的8%懸浮劑和50%水分散粒劑的RSD分別為0.71%和0.41%，分別小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.98和1.50，說(shuō)明分析方法精密度的結(jié)果符合質(zhì)量控制的基本要求。

表1 8%葉菌唑懸浮劑精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 50%葉菌唑水分散粒劑精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱取含25.0 mg (精確至0.1 mg)葉菌唑的8%葉菌唑懸浮劑和50%水分散粒劑各5份，置于50 mL容量瓶中，分別加入葉菌唑標(biāo)樣25.0 mg，按1.5.2節(jié)的方法配制有效成分準(zhǔn)確度溶液。以線性關(guān)系試驗(yàn)中1 009.2 mg/L葉菌唑溶液為標(biāo)樣溶液，計(jì)算葉菌唑的回收率(表3和表4)。8%葉菌唑懸浮劑和50%水分散粒劑中葉菌唑平均回收率分別為99%、100%，表明此分析方法具有良好的準(zhǔn)確度。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，本文測(cè)定葉菌唑所采用的分析方法，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，具有準(zhǔn)確及分離效果好的優(yōu)點(diǎn)，能滿足產(chǎn)品的日常檢驗(yàn)和質(zhì)量控制要求，也為對(duì)葉菌唑單一異構(gòu)體定量分析提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。

表4 50%葉菌唑水分散粒劑回收率試驗(yàn)結(jié)果