重組甘油單酯脂肪酶GMGL的高效表達(dá)及固定化

牛亞春，藍(lán)東明，王永華，楊博*

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

具有特異性底物專一性的生物酶在工業(yè)領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。與常見的甘油三酯水解酶（EC 3.1.1.3）不同[1-3]，甘油單酯脂肪酶（monoacylglycerol lipases，EC 3.1.1.23）能專一地作用于甘油單酯，將其水解成脂肪酸和甘油[4]。由于其高度專一的底物特異性，可應(yīng)用于合成高純度甘油二酯[5]或者甘油單酯[6]，而甘油單酯是重要的乳化劑、穩(wěn)定劑、藥品添加劑及防腐劑等[7,8]。另外，甘油單酯脂肪酶在人體中具有重要的生理調(diào)控作用，如介導(dǎo)2-花生四烯酸甘油酯（2-AG）信號(hào)傳導(dǎo)和花生四烯酸代謝[9,10]，是重要的藥物研發(fā)靶蛋白。

微生物來(lái)源的甘油單酯脂肪酶具有顯著的耐熱性能及催化活力，更具有工業(yè)應(yīng)用潛力，其發(fā)掘及結(jié)構(gòu)功能的研究一直是熱點(diǎn)。Imamural等[4]對(duì)來(lái)源于Bacillussp. H-257的甘油單酯脂肪酶MGLP的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明其最適反應(yīng)溫度為75 ℃，最適pH 6～8；Riegler-Berket等[11]研究了來(lái)源于Arabidopsis thaliana的甘油單酯脂肪酶AtMAGL的底物特異性、區(qū)域特異性及脂肪酸特異性；Kim等[12]研究了甘油單酯脂肪酶MGL的蓋子結(jié)構(gòu)及功能關(guān)系；隨后，唐薇[13]對(duì)來(lái)源于Geobacillussp.12AMOR1的甘油單酯脂肪酶GMGL進(jìn)行克隆表達(dá)，首次解析了海洋微生物來(lái)源的甘油單酯脂肪酶的晶體結(jié)構(gòu)，并研究了GMGL識(shí)別及水解底物的過程。

固定化酶是提高游離酶應(yīng)用性能的有效方法之一，如提升生物酶的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)使用壽命及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[14-16]。常見的固定化方法主要包括吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法和熱處理法等，其中吸附法是通過疏水相互作用、范德華力等物理相互作用力，將酶分子和樹脂相互結(jié)合，使用此類結(jié)合方法常見的樹脂有大孔吸附樹脂，但其固定后的酶分子易脫落，性能不穩(wěn)定，影響固定化酶的重復(fù)利用。因此，為解決大孔吸附樹脂所固定的酶使用壽命短的問題，尋找一種新的樹脂用于固定化很有意義。ECR8285樹脂是一種環(huán)氧丙烯酸酯樹脂，主要通過共價(jià)結(jié)合作用使酶分子表面上的非必需基團(tuán)與載體材料表面上的活性官能團(tuán)實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)共價(jià)結(jié)合，與大孔吸附樹脂相比，該方法獲得的固定化酶具有更高的固定化效率及較長(zhǎng)的使用壽命。Li等[17,18]通過共價(jià)結(jié)合方法將偏甘油酯脂肪酶SMG1-F278N固定在ECR8285樹脂，與游離脂肪酶相比，固定化SMG1-F278N的熱穩(wěn)定性顯著提高，重復(fù)使用7次后催化活力保留率仍為98.00%。由此可見，ECR8285樹脂由于其牢固的共價(jià)結(jié)合方式用于固定化酶載體具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

目前，甘油單酯脂肪酶的研究主要集中在基因挖掘、酶學(xué)性質(zhì)表征及晶體結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系等[11,12]，但已報(bào)道的甘油單酯脂肪酶產(chǎn)量低，難以滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需求及游離酶無(wú)法重復(fù)利用等缺點(diǎn)，且迄今為止關(guān)于重組甘油單酯脂肪酶高效表達(dá)的發(fā)酵條件優(yōu)化又尚未報(bào)道。因此，為降低產(chǎn)業(yè)化成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，本研究以甘油單酯脂肪酶GMGL重組大腸桿菌為研究對(duì)象，在5 L發(fā)酵罐中研究了誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)pH以及葡萄糖補(bǔ)料方式對(duì)重組工程菌表達(dá)甘油單酯脂肪酶的影響，并以環(huán)氧樹脂ECR8285為固定化材料，研究了酶載量、緩沖鹽濃度以及緩沖液pH對(duì)GMGL固定化的影響。研究結(jié)果為后期甘油單酯脂肪酶的高效表達(dá)和固定化酶制備提供研究基礎(chǔ)，以期獲得生物化工和食品化工領(lǐng)域應(yīng)用的甘油單酯脂肪酶固定化酶制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

重組大腸桿菌表達(dá)菌株pET30a-GMGL/BL21（DE3）由華南理工大學(xué)生物化工實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏。

1.1.2 生化試劑

酵母粉、蛋白胨、一水葡萄糖、卡那霉素等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；單硬脂酸甘油酯（MAG）購(gòu)自上海麥克林試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱，重慶市永生試驗(yàn)儀器廠；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；SKY2102C型搖床，SUKUN；全自動(dòng)凝膠成像儀，BIO-RAD；5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40D生物傳感儀，山東省科學(xué)院生物研究所；Merlin型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，Zeiss；Nicolet IS50-Nicolet Continuum型傅里葉變換紅外光譜儀-紅外顯微鏡，Thermo Fisher Scientific。

1.1.4 培養(yǎng)基

搖瓶種子液培養(yǎng)基（L-1）：10 g胰蛋白胨，5 g酵母粉，10 g NaCl，補(bǔ)加終濃度為50 μg/mL的卡那霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基（L-1）：10 g一水葡萄糖，11.5 g酵母膏，19.5 g蛋白胨，4 g (NH4)2SO4，0.9 g檸檬酸，18 g K2HPO4·3H2O，3 g KH2PO4，1.2 g MgSO4（單獨(dú)滅菌），微量元素液1 mL。

微量元素溶液（L-1）：2.8 g FeSO4·7H2O，2 g MnCl2·4H2O，2.8 g CoSO4·7H2O，1.5 g CaCl2·2H2O，0.2 g CuCl2·2H2O，0.3 g ZnSO4·7H2O，溶于1 mol/L HCl中。

補(bǔ)料培養(yǎng)基（L-1）：600 g葡萄糖，10 g MgSO4·7H2O。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備

凍存的重組大腸桿菌在LB固體培養(yǎng)基上（含卡那霉素50 μg/mL）37 ℃劃線，培養(yǎng)12～18 h。接種單菌落到5 mL LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的條件培養(yǎng)12～14 h；將上述培養(yǎng)物按1%的接種量加到150 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，OD600=2～6左右。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件

5 L發(fā)酵罐中裝液量為3 L，接種量5%，發(fā)酵培養(yǎng)溫度37 ℃，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流速使溶氧不低于10%，流加氨水控制pH 7.0左右。分批培養(yǎng)4 h后，進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，葡萄糖流加速度為12.5 g/h。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為1 mmol/L，27 h時(shí)停止補(bǔ)料，31 h時(shí)停止發(fā)酵。誘導(dǎo)階段每4 h取樣，測(cè)定細(xì)胞濕重、酶活、葡萄糖殘留含量。誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)置為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期（2 h）、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（4 h）和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期（7 h）；誘導(dǎo)溫度設(shè)置為25 ℃、30 ℃和35 ℃；誘導(dǎo)pH設(shè)置為6.5、7.0和7.5。

葡萄糖流加方式分別設(shè)定為恒速流加、變速流加、指數(shù)流加和pH-STAT。（1）恒速流加葡萄糖流速為12.5 g/h；（2）變速流加控制發(fā)酵液中葡萄糖含量低于5 g/L；（3）指數(shù)流加控制比生長(zhǎng)速率為0.065 h-1；（4）pH-STAT串聯(lián)pH和補(bǔ)料，當(dāng)pH低于7.0時(shí)流加葡萄糖。

1.2.3 GMGL酶活力檢測(cè)

取15 mL發(fā)酵液離心去上清，菌體用15 mL pH 7.5的10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液重懸菌體，超聲破壁15 min，離心所得上清即為GMGL粗酶液。GMGL酶活力測(cè)定參見唐微等的方法[13]并加以修改。取4 g乳化液（4%的聚乙烯醇(PVA):MAG體積比為3:1）加入5 mL pH 7.5磷酸鹽緩沖液，空白對(duì)照中加入15 mL 95%的乙醇，于150 r/min，60 ℃搖床中預(yù)熱5 min，預(yù)熱后加入1 mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液，然后反應(yīng)10 min。待反應(yīng)結(jié)束后立即加入15 mL 95%的乙醇終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后加入2滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定。在一定反應(yīng)條件下，每分鐘催化底物水解生成1 μmol脂肪酸所需要的酶量定義為1 U。

1.2.4 發(fā)酵液中葡萄糖含量測(cè)定

用SBA-40D生物傳感儀測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖含量。

1.2.5 GMGL的固定化

將粗酶液濃縮至5000 U/mL，取部分酶液與樹脂ECR8285按不同固定化條件進(jìn)行混合，25 ℃固定時(shí)間為8 h。真空泵除去吸附后殘液，將待干燥固定化酶置于35 ℃真空干燥箱干燥8 h，控制水分含量在5%以下，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。固定化條件：（1）酶載量為50、100、150、200和250 mg/g；（2）緩沖液鹽濃度為0.05、0.10、0.30、0.50和1.00 mol/L；（3）緩沖液pH為5、6、7、8、9和10。

1.2.6 固定化GMGL的表征

1.2.6.1 固定化酶GMGL的SEM表征

根據(jù)Liu等[19]的方法，利用SEM研究GMGL固定前后環(huán)氧樹脂ECR8285的表面形貌。

1.2.6.2 固定化酶GMGL的FT-IR表征

FT-IR光譜檢測(cè)參照Liu等[19]的方法。

1.2.7 固定化酶GMGL的蛋白吸附量測(cè)定

蛋白吸附量測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[17]。

1.2.8 固定化酶水解活力測(cè)定方法

固定化GMGL酶活力測(cè)定參見唐微等[13]方法并加以修改。取4 g已制備好的乳化劑（4%的PVA：?jiǎn)斡仓岣视王ンw積比為3:1）加入5 mL pH 7.5磷酸鹽緩沖液，空白對(duì)照中加入15 mL 95%乙醇，設(shè)定轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度為60 ℃搖床中預(yù)熱5 min，預(yù)熱后加入0.01 g固定化GMGL，然后反應(yīng)10 min。待反應(yīng)結(jié)束后立即加入15 mL 95%的乙醇終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后加入2滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

以上每項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均設(shè)置三個(gè)平行。用Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算所有數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用Origin 2021軟件作圖，SPSS 9.0進(jìn)行分析，顯著性水平p<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組大腸桿菌高效表達(dá)GMGL的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組大腸桿菌表達(dá)GMGL的影響

lac啟動(dòng)子是一種常用的由乳糖或其類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)劑IPTG在不同的生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)目的基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生顯著性差異。Sriubolmas等[20]采用大腸桿菌DH5α（pQEA11）生產(chǎn)青霉素?；笗r(shí)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期和中期進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，青霉素?；傅谋磉_(dá)量不高，但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，青霉素?；傅谋磉_(dá)量顯著提高。因此，分別在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期、中期和后期添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，探究不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)水平的影響。如圖1c，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期和中期進(jìn)行誘導(dǎo)，菌體生長(zhǎng)情況受到影響，最大細(xì)胞濕重只能達(dá)到99.88 g/L，可能是由于細(xì)胞較早地開始合成GMGL，從而給菌體后期的生長(zhǎng)帶來(lái)壓力，提前誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中的葡萄糖提前積累。如圖1a和1b，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期誘導(dǎo)更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，同時(shí)提高了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率，發(fā)酵31 h時(shí)，酶活力達(dá)到1550 U/mL，比對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期誘導(dǎo)提高了30.80%，比對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期誘導(dǎo)提高了21.40%。這一結(jié)果表明在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期開始誘導(dǎo)，有利于GMGL的表達(dá)，為探究誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)其他重組蛋白表達(dá)的影響提供良好的借鑒。

圖1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵過程的影響Fig.1 Effect of induction time on the fermentation process of recombinant E. coli

2.1.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組大腸桿菌表達(dá)GMGL的影響

誘導(dǎo)溫度是影響菌體生長(zhǎng)和調(diào)控產(chǎn)物合成的重要因素。丁蘭寶等[21]報(bào)道較高的誘導(dǎo)溫度有利于大腸桿菌的高密度發(fā)酵，但低溫誘導(dǎo)能提高目的產(chǎn)物的合成，而且在不同培養(yǎng)階段采用不同的培養(yǎng)溫度有利于提高大腸桿菌的生長(zhǎng)密度和重組產(chǎn)物的表達(dá)量，可縮短發(fā)酵周期。此外，一些研究表明，培養(yǎng)溫度的升高會(huì)導(dǎo)致工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性變差，造成質(zhì)粒丟失。本研究生探究了不同誘導(dǎo)溫度對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)GMGL的影響，如圖2c，在35 ℃條件下誘導(dǎo)，發(fā)酵19 h時(shí)，細(xì)胞濕重達(dá)到最高125.40 g/L，之后細(xì)胞濕重開始下降，23 h時(shí)發(fā)酵液中開始積累葡萄糖，27 h時(shí)殘?zhí)橇窟_(dá)到最高2.40 g/L，酶活達(dá)到最高1233 U/mL。在30 ℃的誘導(dǎo)溫度下，發(fā)酵23 h時(shí)，細(xì)胞濕重達(dá)到最高123.98 g/L。如圖2a和2b，隨后發(fā)酵液中的葡萄糖大量積累，細(xì)胞濕重和酶活力開始下降，31 h時(shí)酶活力為1075 U/mL。在25 ℃的誘導(dǎo)溫度下，發(fā)酵19 h時(shí)細(xì)胞濕重開始下降，但酶活力繼續(xù)增加，發(fā)酵31 h時(shí)達(dá)到最高1550 U/mL，比30 ℃和35 ℃分別提高了44.19%和29.38%，說(shuō)明低溫更有利于甘油單酯脂肪酶活力的提高。這一現(xiàn)象在其他研究中也有報(bào)道[22]，推測(cè)一是低溫有利于外源蛋白質(zhì)的有效折疊；二是在低溫條件下，乙酸等代謝產(chǎn)物的積累減少，降低了細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的毒害作用。

圖2 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵過程的影響Fig.2 Effect of induction temperature on the fermentation process of recombinant E. coli

2.1.3 誘導(dǎo)pH對(duì)重組大腸桿菌表達(dá)GMGL的影響

發(fā)酵過程中維持穩(wěn)定的pH是使細(xì)胞保持最佳生理狀態(tài)的必要條件。一方面，外界pH值的變化會(huì)通過弱酸或弱堿的變化改變細(xì)胞內(nèi)的pH，從而影響細(xì)胞的生理代謝。另一方面，大腸桿菌利用碳源產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物即有機(jī)酸的積累，會(huì)造成pH值的下降；而有機(jī)酸的消耗，以及無(wú)機(jī)氮源的利用，則會(huì)造成pH值上升。在發(fā)酵過程中，通過流加低濃度的堿對(duì)pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而控制發(fā)酵液的pH處于適宜的范圍內(nèi)，可以避免pH值的劇烈變化對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝造成不利影響。分別控制誘導(dǎo)pH為6.5、7.0和7.5，探究了不同恒定pH發(fā)酵條件下對(duì)甘油單酯脂肪酶重組表達(dá)的影響。如圖3b和3c，在pH 7.5條件下誘導(dǎo)更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)酵6～23 h時(shí)GMGL酶活力更高，發(fā)酵31 h時(shí)酶活為1485 U/mL。在pH 7.0條件下誘導(dǎo)，相比pH 6.5和pH 7.5，27 h時(shí)發(fā)酵液中葡萄糖積累量最小為2.05 g/L，且甘油單酯脂肪酶關(guān)于葡萄糖的得率最高。如圖3a，在pH 6.5條件下誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中殘?zhí)橇恐饾u增加，27 h時(shí)殘?zhí)橇孔罡邽?.84 g/L，發(fā)酵31 h時(shí)GMGL酶活力達(dá)到1298 U/mL。結(jié)果表明，不同誘導(dǎo)pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大，但pH 7.0更有利于甘油單酯脂肪酶的合成。因此，研究誘導(dǎo)pH對(duì)重組蛋白的表達(dá)具有重要意義。

圖3 誘導(dǎo)pH對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵過程的影響Fig.3 Effect of induction pH on the fermentation process of recombinant E. coli

2.1.4 葡萄糖流加方式對(duì)重組大腸桿菌表達(dá)GMGL的影響

大腸桿菌在過量葡萄糖或缺氧的條件下會(huì)發(fā)生葡萄糖效應(yīng)，積累大量有機(jī)酸而影響重組菌的生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)[23]。大腸桿菌高密度發(fā)酵中，葡萄糖的合理流加方式是關(guān)鍵的影響因素。分別研究了恒速流加補(bǔ)料、變速補(bǔ)料、指數(shù)補(bǔ)料和pH-STAT等4種方式對(duì)重組酶表達(dá)的影響。如圖4c，恒速流加條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)較快，發(fā)酵19 h時(shí)達(dá)到116.75 g/L，由于誘導(dǎo)前期葡萄糖流加速度過快，細(xì)胞代謝過快喪失活力，19 h后細(xì)胞衰老死亡。變速流加條件下，控制發(fā)酵液中葡萄糖殘留含量低于5 g/L，限制性地流加葡萄糖，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸增加，31 h時(shí)達(dá)到最高1985 U/mL（圖4b），重組蛋白的表達(dá)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化見4d，蛋白分子量與唐薇[13]預(yù)測(cè)大小一致，約為28 ku。指數(shù)流加條件下，4～19 h細(xì)胞能按照恒定比生長(zhǎng)速率0.065 h-1生長(zhǎng)，但由于發(fā)酵液中葡萄糖大量積累，19 h后細(xì)胞大量死亡，發(fā)酵31 h時(shí)酶活達(dá)到1255 U/mL。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)菌比生長(zhǎng)速率高乙酸的比生成率就高，當(dāng)重組菌的生長(zhǎng)速率超過某個(gè)臨界值便產(chǎn)生乙酸[24]，指數(shù)流加結(jié)果表明，降低該重組大腸桿菌的比生長(zhǎng)速率有利于甘油單酯脂肪酶的合成。如圖4a，pH-STAT流加條件下，發(fā)酵液中葡萄糖含量一直維持在較低水平，且細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，可能碳源不足，發(fā)酵31 h酶活達(dá)到1420 U/mL。大腸桿菌代謝葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中pH的降低，pH的下降在一定程度上反映了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的需求，因此通過pH變化調(diào)節(jié)葡萄糖流加速率可以有效避免葡萄糖和乙酸的積累，但該方法的缺點(diǎn)就是pH的變化相對(duì)比較滯后，往往細(xì)胞已經(jīng)處于饑餓狀態(tài)[25]。

圖4 葡萄糖流加方式對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵過程的影響及GMGL的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.4 Effect of glucose feeding on the fermentation process of recombinant E. coli and SDS-PAGE test results of GMGL

2.2 重組甘油單酯脂肪酶GMGL的固定化

2.2.1 酶載量對(duì)GMGL固定化的影響

本實(shí)驗(yàn)探究了酶載量對(duì)GMGL固定化的影響，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)酶載量小于100 mg/g時(shí)，蛋白吸附量隨著酶載量的增加而增加；當(dāng)酶載量為100 mg/g時(shí)，固定化GMGL活力最高為2735 U/g，比活力為32.35 U/mg，蛋白吸附量為84.55 mg/g；當(dāng)酶載量大于100 mg/g樹脂時(shí)，蛋白吸附量不會(huì)隨著酶載量的增加而增大而是逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，說(shuō)明ECR8285樹脂對(duì)GMGL的吸附量達(dá)到飽和狀態(tài)。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)ECR8285樹脂對(duì)SMG1-F278N的吸附量也存在一個(gè)飽和臨界值，為30 mg/g。以上結(jié)果表明樹脂對(duì)酶的吸附都存在一個(gè)飽和臨界值。酶加量超過這個(gè)臨界值，在固定化過程中會(huì)造成酶原料的浪費(fèi)，額外增加生產(chǎn)成本。因此，研究酶載量對(duì)GMGL固定化的影響，對(duì)實(shí)現(xiàn)固定化GMGL的低成本的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

圖5 酶載量對(duì)GMGL固定化的影響Fig.5 Effect of lipase/support ratio on the immobilization of GMGL

2.2.2 緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)GMGL固定化的影響

離子強(qiáng)度影響酶在載體疏水表面的物理吸附。本實(shí)驗(yàn)探究了不同離子強(qiáng)度對(duì)固定化GMGL活力、比活力及蛋白吸附量的影響，結(jié)果如圖6所示，在離子強(qiáng)度為0.50 mol/L時(shí)，酶活力達(dá)到2925 U/g，比活力為39.63 U/mg，蛋白吸附量為73.79 mg/g，相比低離子強(qiáng)度條件下（0.05 mol/L）酶活力提高了181.25%，這表明GMGL固定化最適的離子強(qiáng)度是0.50 mol/L，Li等[17]通過提高鹽離子強(qiáng)度使固定化SMG1-F278N的酶活力提高了275.00%。這些結(jié)果表明提高鹽離子強(qiáng)度有助于固定化酶活力的提高。分析原因是高離子強(qiáng)度緩沖液有利于酶與載體的疏水表面發(fā)生吸附，進(jìn)一步有助于載體的環(huán)氧基團(tuán)與酶的氨基或巰基發(fā)生反應(yīng)，形成非常穩(wěn)定的共價(jià)鍵，提高酶的有效吸附率[26]。這一研究結(jié)果為后期環(huán)氧樹脂做固定化材料提供合適的緩沖液離子強(qiáng)度參考值，具有重要意義。

圖6 緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)GMGL固定化的影響Fig.6 Effect of buffer ionic strength on the immobilization of GMGL

2.2.3 緩沖液pH對(duì)GMGL固定化的影響

緩沖液的pH值是影響固定化酶活力的關(guān)鍵因素，因?yàn)樗鼤?huì)影響酶的活性構(gòu)象和結(jié)構(gòu)[17]。因此，本實(shí)驗(yàn)探究了不同pH對(duì)GMGL固定化的影響，結(jié)果如圖7所示，GMGL固定化最適緩沖液pH為9，固定化GMGL活力為4770 U/g，較pH 5提高了189.09%。不同緩沖溶液pH值的蛋白吸附量幾乎一致，但比活力和酶活力都先增加后減小。這一結(jié)果與Harris等[27,28]報(bào)道一致，表明酶活性中心的解離基團(tuán)隨固定化體系pH值的變化而變化，從而影響固定化酶的活性。因此，選用酶載量為100 mg/g、緩沖液離子強(qiáng)度為0.50 M和緩沖液pH為9的條件，用于制備固定化GMGL的工藝，為甘油單酯脂肪酶的固定化研究提供了理論依據(jù)。

圖7 緩沖液pH對(duì)GMGL固定化的影響Fig.7 Effect of initial pH of buffer on the immobilization of GMGL

2.3 固定化GMGL的表征

2.3.1 固定化GMGL的SEM表征和FT-IR表征

利用SEM對(duì)環(huán)氧樹脂ECR8285，固定化GMGL及游離GMGL進(jìn)行比較分析。由圖8可見，環(huán)氧樹脂ECR8285表面較光滑，而固定GMGL之后，其表面有明顯凸起附著物，表明GMGL酶分子與環(huán)氧樹脂ECR8285成功結(jié)合[29,30]。進(jìn)一步利用FT-IR進(jìn)行表征分析（圖9），固定化GMGL和游離GMGL分別在1562.34 cm-1和1631.77 cm-1出現(xiàn)蛋白質(zhì)特有的一級(jí)結(jié)構(gòu)中-NH-鍵的吸收峰，而在ECR8285樹脂紅外光譜中未發(fā)現(xiàn)-NH-鍵的吸收峰，再次表明游離GMGL已成功固定在ECR8285樹脂上。

圖8 ECR8285(a)、固定化GMGL(b,c)和游離GMGL(d)電鏡圖 Fig.8 Scanning electron micrographs of surface of resin ECR8285 (a)，immobilized GMGL (b,c) and free GMGL (d)

圖9 游離GMGL、固定化GMGL和ECR8285樹脂的FT-IR圖譜Fig.9 FT-IR spectra of free GMGL, immobilized GMGL and resin ECR8285

3 結(jié)論

本研究在5 L發(fā)酵罐體系中探究了不同誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、pH和葡萄糖補(bǔ)料方式對(duì)重組大腸桿菌生長(zhǎng)和甘油單酯脂肪酶GMGL合成的影響。確定了最佳發(fā)酵條件為重組大腸桿菌在25 ℃，pH 7.0，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期進(jìn)行誘導(dǎo)，葡萄糖流加方式為變速流加，優(yōu)化后甘油單酯脂肪酶酶活力達(dá)到1985 U/mL，較優(yōu)化前提高了67.50%。通過共價(jià)結(jié)合的方式將GMGL固定到環(huán)氧樹脂ECR8285上，對(duì)GMGL進(jìn)行固定化研究，確定最佳固定化條件為酶載量為100 mg/g，磷酸鹽緩沖液離子強(qiáng)度為0.50 M，pH為9，優(yōu)化后固定化酶GMGL活力為4770 U/g，較優(yōu)化前提高了189.09%。利用掃描電鏡（SEM）和傅里葉紅外光譜（FT-IR）進(jìn)行表征，證實(shí)GMGL成功負(fù)載在ECR8285上。本研究首次將甘油單酯脂肪酶成功固定在ECR8285上，豐富了固定化酶制劑種類，優(yōu)化結(jié)果也為甘油單酯脂肪酶固定化酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供了一種新策略。