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    黃芪莖葉的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)

    2021-11-05 10:15:28李慧李靜輝崔瑩馬德志張可勇劉吉成
    現(xiàn)代食品科技 2021年10期
    關(guān)鍵詞:雄鼠雌鼠黃芪

    李慧,李靜輝,崔瑩,馬德志,張可勇,劉吉成

    (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研處,黑龍江齊齊哈爾 161006)

    黃芪是豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao]或膜莢黃芪[Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.]的干燥根,在《本草綱目》中將其列為上品。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為:黃芪味甘,性微溫,歸肺、脾經(jīng);具有補(bǔ)氣升陽(yáng),利水消腫,斂瘡生肌的功能;用于氣虛乏力,中氣下陷,血虛萎黃等癥[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,黃芪中含黃芪多糖、皂苷類、黃酮類和多種氨基酸等主要成分,其藥理作用表現(xiàn)為提高免疫力,抗氧化、抗輻射和抗癌,保護(hù)心腦血管,提高記憶力,抗菌和抗病毒,降低血糖、血脂和減少糖尿病并發(fā)癥等作用[2]。除藥用外,黃芪常被用作食補(bǔ)的最佳原料之一,清代名醫(yī)黃宮繡的《本草求真》中稱其為“補(bǔ)氣諸藥之最”,具有極大的食用價(jià)值[3]。國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布了將黃芪按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點(diǎn)工作的通知,研究適時(shí)將其納入食藥物質(zhì)目錄管理。

    黃芪莖葉是黃芪的地上嫩莖和葉部分,應(yīng)用歷史悠久,被用于藥用和食用兩個(gè)方面。黃芪莖葉的藥用功效記載已有近2000年,始見(jiàn)于《名醫(yī)別錄》,即“莖葉主治療渴及筋攣,癰腫,疽瘡”,后有《本草綱目》和《千金翼方》中均有記載。黃芪莖葉與黃芪根化學(xué)成分相似,只是含量有所不同[4,5]。部分成分甚至高于根中的含量,楊桂明等[6]研究顯示果盛期葉中的黃芪總皂苷含量高于根中,且此時(shí)期采收地上部分對(duì)黃芪根產(chǎn)量無(wú)明顯影響。黃芪莖葉中含有黃芪甲苷,且含量高于根部[7],具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降糖和改善心血管疾病等藥理作用[8];含有黃芪多糖,含量稍低于根部[9],具有增強(qiáng)免疫力,提高免疫細(xì)胞的免疫活性,且具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、保護(hù)心血管、保肝護(hù)腎等作用[10];含有較高含量的總黃酮,并測(cè)定了其抗氧化活性[11],除此之外,總黃酮還具有抗腫瘤、抗突變和抗損傷的作用[12-14]。其食用歷史記載也有600多年,始見(jiàn)于《救荒本草》(公元1406年),其中黃芪莖葉食用記載為“采嫩苖葉煠熟,換水浸淘洗去苦味,油鹽調(diào)食,藥中補(bǔ)益呼為羊肉”。明代鮑山所匯輯而成的《野菜博錄》中記載:“黃芪莖葉食法,采嫩苗葉煠熟,換水浸淘去苦味,油鹽調(diào)食?!薄侗静菥V目》校點(diǎn)本上冊(cè)第2版中記載:“黃芪無(wú)毒,屬藥用植物,其莖葉花也可食用?!苯陙?lái),我國(guó)黑龍江大興安嶺、內(nèi)蒙古等地區(qū)均有食用黃芪莖葉的歷史,已將其作為健康食品、代茶飲等食品的重要原料,并展現(xiàn)出了較好的市場(chǎng)前景。

    目前關(guān)于黃芪莖葉的研究主要在有效成分及其藥理作用方面,但作為食品原料廣泛應(yīng)用的毒理學(xué)研究不夠深入,相關(guān)證據(jù)缺乏。而將黃芪莖葉作為食品原料或?qū)⑵涮崛∥镞M(jìn)行加工并研發(fā)出相關(guān)保健食品,可有效增加黃芪的附加值,產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。因此,開(kāi)展其毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)尤為重要。鑒于國(guó)內(nèi)黃芪莖葉毒理學(xué)數(shù)據(jù)缺乏的現(xiàn)狀,對(duì)其開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn),為深度挖掘黃芪莖葉原料的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 原料

    試驗(yàn)樣品采集自黑龍江齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院黃芪種植基地,樣品呈淡綠色或黃綠色,葉片為羽狀復(fù)葉。樣品處理工藝為:利用熱回流提取濃縮回收裝置對(duì)干黃芪莖葉原料進(jìn)行提取,按照料液比為1:15的比例,加水浸泡30 min,在微沸狀態(tài)下提取2次,每次2.5 h,合并提取液,過(guò)濾;濾過(guò)的殘?jiān)凑樟弦罕葹?:12的比例,加入75%的乙醇回流提取2次,每次2 h,合并提取液,過(guò)濾。將水提和醇提的濾液合并,在70~75 ℃,負(fù)壓0.04 Mpa的條件下進(jìn)行濃縮,濃縮液利用噴霧干燥塔進(jìn)行干燥成粉末狀,干燥設(shè)置瞬時(shí)溫度180 ℃,流速2 L/h。1 g提取物粉相當(dāng)于12.50 g樣品原料。

    1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

    試驗(yàn)過(guò)程中使用的SPF級(jí)ICR小鼠和SD大鼠,均來(lái)自于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠體重20±2 g,大鼠200±20 g,均雌雄各半用于急性經(jīng)口毒性試驗(yàn),生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(浙)2014-0001,使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2014-0008;小鼠體重25~30 g,用于遺傳毒性試驗(yàn),生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(浙)2014- 0001,使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2014-0008;大鼠70±10 g,雌雄各半用于90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn),生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(浙)2014-0001,使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2016-0022。室溫20~25 ℃,相對(duì)濕度為40%~70%。

    1.3 儀器與試劑

    試驗(yàn)所用儀器,主要有羅氏C311全自動(dòng)生化分析儀、全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀,江西特康科技有限公司;OLYMPUSBH-2型顯微鏡、電子天平、解剖器械、超凈工作臺(tái)。

    主要試劑包括環(huán)磷酰胺、秋水仙素、絲裂霉素、2-乙酰氨基芴、疊氮鈉以及1,8-二羥基蒽醌等。

    1.4 試驗(yàn)方法

    1.4.1 大、小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

    選取ICR小鼠和SD大鼠各20只,雌雄各半,按限量法設(shè)20.00 g/kg BW(相當(dāng)于干制黃芪莖葉原料250.00 g/kg BW)一個(gè)劑量組。灌胃前禁食6 h,小鼠按20 mL/kg灌胃2次,每次間隔4 h;大鼠按10 mL/kg灌胃3次,每次間隔4 h。小、大鼠末次灌胃分別2 h和3 h后恢復(fù)進(jìn)食。記錄鼠的一般狀況、中毒表現(xiàn)和死亡情況。觀察14 d,記錄試驗(yàn)初期及末期動(dòng)物體重,結(jié)束后處死動(dòng)物,進(jìn)行大體解剖檢查,記錄大體病理學(xué)變化。

    1.4.2 遺傳毒性試驗(yàn)

    1.4.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

    選用TA97a、TA98、TA100、TA102作為試驗(yàn)菌株,以無(wú)菌DMSO將提取物粉稀釋至8、40、200、1000和5000 μg/皿的梯度,外加空白組、溶劑組和陰性對(duì)照組,在加和不加S9的條件下進(jìn)行測(cè)試,直接測(cè)定培養(yǎng)基上各菌株的回變菌落數(shù)。

    1.4.2.2 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

    選取小鼠50只,分為5組,每組10只,雌雄各半。試驗(yàn)設(shè)2.50、5.00和10.00 g/kg BW(相當(dāng)于干制黃芪莖葉原料31.25、62.50、125.00 g/kg BW)三個(gè)不同劑量組,另設(shè)一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺40 mg/kg BW)和一個(gè)陰性對(duì)照組(1%羥甲基纖維素鈉)。小鼠按20 mL/kg BW經(jīng)口灌胃,共計(jì)2次,間隔24 h。灌胃結(jié)束6 h后頸椎脫臼處死,取胸骨骨髓制成骨髓片,甲醇固定,Giemsa染色。觀察每個(gè)動(dòng)物的紅細(xì)胞、嗜多染紅細(xì)胞并計(jì)數(shù)有微核嗜多染紅細(xì)胞率,采用Poisson分析法對(duì)劑量組與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較。

    1.4.2.3 小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

    選用雄性小鼠25只,分為5組,每組5只。三個(gè)劑量組、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組、灌胃容量均與哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)設(shè)置相同,連續(xù)灌胃5 d,每天1次。于第一次灌胃后的第13 d處死小鼠,處死前5 h腹腔注射秋水仙素6 mg/kg BW。取兩側(cè)睪丸曲細(xì)精管中濾液進(jìn)行滴片、染色和鏡檢。每組觀察500個(gè)中期分裂細(xì)胞,計(jì)算各組不同類型的染色體結(jié)構(gòu)畸變頻率、常染色體單價(jià)體以及性染色體單價(jià)體等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    1.4.3 90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

    選擇SPF級(jí)健康大鼠100只,雌雄各半,每籠飼養(yǎng)2只大鼠。以人體推薦量的75、150、300倍設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組(相當(dāng)于原料3.75、7.50、15.00 g/kg BW),另設(shè)1個(gè)陰性對(duì)照組和2個(gè)衛(wèi)星組。試驗(yàn)組每組20只鼠,衛(wèi)星組每組10只鼠,雌雄各半。將黃芪莖葉提取物按體重8%折算摻入飼料中喂養(yǎng),大鼠自由進(jìn)食,每周記錄大鼠體重變化情況和進(jìn)食量。試驗(yàn)中期衛(wèi)星組大鼠采尿測(cè)尿常規(guī)后禁食過(guò)夜,次日按0.50 mL/100 g BW腹腔注射8%水合氯醛麻醉,按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)處死,測(cè)定血液學(xué)與血生化指標(biāo)值。試驗(yàn)?zāi)┢诎凑罩衅谛l(wèi)星組大鼠處理方法采血處死,每只大鼠取腦、心臟、肝臟、脾臟、睪丸、卵巢等器官稱重,計(jì)算臟體比并進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

    1.4.4 統(tǒng)計(jì)分析

    利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊則采用單因素方差分析,方差不齊進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換或秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以p<0.05作為是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

    在試驗(yàn)期間,大、小鼠均無(wú)明顯中毒現(xiàn)象,無(wú)死亡情況,大體解剖各臟器均無(wú)病理性改變。干制黃芪莖葉提取物對(duì)大、小鼠經(jīng)口LD50均大于20.00 g/kg BW(相當(dāng)于干制黃芪莖葉原料250.00 g/kg BW),屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)(表1)。這與丁伯良等[15]的研究結(jié)果不同,該研究利用膜莢黃芪莖葉粉進(jìn)行小鼠毒性反應(yīng)試驗(yàn),結(jié)果顯示日糧中搭配20%的莖葉粉時(shí)小鼠第32 d中毒死亡,中毒癥狀類似瘋草中毒。然而多篇文獻(xiàn)報(bào)道,蒙古黃芪和膜莢黃芪莖葉中不含有瘋草中的可導(dǎo)致中毒物質(zhì),其產(chǎn)生的結(jié)果可能是實(shí)驗(yàn)給小鼠服用了黃芪屬中其他形態(tài)上類似于膜莢黃芪的有毒植物[16]。

    表1 干制黃芪莖葉小、大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)Table 1 Acute oral toxicity of Astragalus stem and leaf in mice and rats

    2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

    2.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

    對(duì)4個(gè)試驗(yàn)菌株的回變菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),不同濃度受試物的回變菌落數(shù)與陰性對(duì)照數(shù)目接近,但陽(yáng)性對(duì)照組的回變數(shù)至少高于未處理對(duì)照組的2倍以上。因此,黃芪莖葉的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性,無(wú)致突變性,且兩次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果相同(表2)。

    表2 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果Table 2 Results of bacterial reverse mutation test

    2.2.2 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

    與陰性對(duì)照組相比,各劑量組含微核細(xì)胞率均無(wú)顯著性差異(p>0.05),陽(yáng)性對(duì)照組則顯著高于陰性對(duì)照組,具有顯著性差異(p<0.01)。表明黃芪莖葉對(duì)小鼠骨髓紅細(xì)胞含微核細(xì)胞率未見(jiàn)明顯影響(表3)。

    表3 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of mammalian erythocyte micronucleus test

    2.2.3 小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

    與陰性對(duì)照組相比,各劑量組染色體異常細(xì)胞率、常染色體和性染色體早分離率均無(wú)顯著性差異(p>0.05),陽(yáng)性對(duì)照組則顯著高于陰性對(duì)照組,具有顯著性差異(p<0.01)。表明黃芪莖葉對(duì)小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)未見(jiàn)明顯影響(表4)。

    表4 小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果Table 4 Results of chromosome aberration test in mouse spermatocytes

    2.3 90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

    試驗(yàn)期間各組動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育良好,未觀察到中毒表現(xiàn)和體征,大鼠眼部檢查、體重、增重、進(jìn)食量、食物利用率、血液及血生化等指標(biāo)均未見(jiàn)損害性影響,解剖及組織學(xué)觀察未見(jiàn)明顯病理組織學(xué)變化。

    2.3.1 對(duì)大鼠增重、進(jìn)食量和食物利用率的影響

    宮新城等[17]對(duì)母體使用黃芪莖葉胎鼠出生重及生長(zhǎng)進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果顯示黃芪莖葉可以提高仔鼠的出生重和增長(zhǎng)速度,其后代體質(zhì)明顯好于對(duì)照組。從表5中可以看出不同劑量組雌雄大鼠的始重、終重、增重及食物利用率與對(duì)照組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。

    表5 干制黃芪莖葉對(duì)大鼠體重、進(jìn)食量及食物利用率的影響Table 5 Effects of Astragalus stem and leaf on body weight, food intake and food utilization of rats

    2.3.2 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)和生化學(xué)指標(biāo)的影響

    試驗(yàn)?zāi)┢冢鲃┝拷M大鼠與陰性對(duì)照組相比,血液學(xué)各指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。結(jié)果顯示黃芪莖葉對(duì)試驗(yàn)大鼠血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞壓積、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類等未見(jiàn)明顯影響(表6)。

    表6 黃芪莖葉對(duì)大鼠血液學(xué)的影響Table 6 Effect of Astragalus stem and leaf on hematology in rats

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,雄性高劑量組大鼠AST、BUN以及雌性低劑量組大鼠TG指標(biāo)明顯低于陰性對(duì)照組(p<0.05),但其檢測(cè)值均在正常值范圍內(nèi),其余指標(biāo)與陰性對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(p>0.05)(表7)。

    表7 黃芪莖葉對(duì)大鼠血生化的影響Table 7 Effect of Astragalus stem and leaf on blood biochemistry in rats

    2.3.3 對(duì)大鼠臟器重量與臟體比的影響

    研究結(jié)果表明,中、高、低劑量組雌雄性別的大鼠臟器重量、臟體比數(shù)值與對(duì)照組相比,結(jié)果均未顯示有顯著差異(p>0.05)(表8)。

    表8 黃芪莖葉對(duì)大鼠臟器重量和臟體比的影響(g)Table 8 Effects of Astragalus stem and leaf on visceral weight and visceral body ratio in rats

    2.3.4 對(duì)大鼠尿液檢查和病理學(xué)檢查的影響

    對(duì)大鼠尿液進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果顯示各組之間無(wú)顯著性差異。病理切片鏡檢顯示陰性對(duì)照組2只雄鼠、高劑量組1只雄鼠可見(jiàn)胃部分腺體輕微擴(kuò)張;陰性對(duì)照組1只雌鼠、高劑量組1只雌鼠可見(jiàn)肝血管周圍少量炎細(xì)胞浸潤(rùn);陰性對(duì)照組1只雌鼠可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性,局灶性;高劑量組1只雄鼠、1只雌鼠可見(jiàn)肝內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)灶,局灶性;陰性對(duì)照組1只雄鼠可見(jiàn)肺血管周圍有1處炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)灶;陰性對(duì)照組1只雌鼠可見(jiàn)肺邊緣有1處炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)灶;高劑量組1只雄鼠可見(jiàn)肺邊緣1處出血;陰性對(duì)照組2只雄鼠、高劑量組1只雌鼠可見(jiàn)部分腎小管上皮嗜堿性變;陰性對(duì)照組1只雄鼠可見(jiàn)腎間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);陰性對(duì)照組1只雌鼠可見(jiàn)腎臟輕微腎盂腎炎,可見(jiàn)腎盂處炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),移行上皮輕微增生;高劑量組1只雄鼠可見(jiàn)腎內(nèi)1處尿囊泡;陰性對(duì)照組1只雌鼠、高劑量組1只雌鼠可見(jiàn)胸腺上皮輕微增生;陰性對(duì)照組1只雌鼠可見(jiàn)卵泡單純性囊泡;陰性對(duì)照組3只雄鼠、高劑量組2只雄鼠可見(jiàn)前列腺間質(zhì)有少量炎細(xì)胞節(jié)段性浸潤(rùn);高劑量組1只雄鼠可見(jiàn)前列腺間質(zhì)有炎細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn),其余未見(jiàn)異常情況。研究結(jié)果綜合顯示,受試物未引起高劑量組雌、雄大鼠相關(guān)的病理組織學(xué)變化,以上變化均為自發(fā)病變,因此,未見(jiàn)受試物引起的動(dòng)物中毒性損傷。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)結(jié)果顯示,干制黃芪莖葉急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)雌雄大小鼠LD50>250.00 g/kg BW,屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)。遺傳毒性試驗(yàn)(細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn))結(jié)果均為陰性,表明該樣品未顯示致突變作用。90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)顯示,試驗(yàn)期間動(dòng)物未出現(xiàn)中毒表現(xiàn)和體征,大體解剖及組織學(xué)觀察也未見(jiàn)明顯與試驗(yàn)因素有關(guān)的病理組織學(xué)變化,對(duì)大鼠眼部檢查、體重、增重、進(jìn)食量和食物利用率、血液學(xué)和生化學(xué)、尿常規(guī)、臟器重量和臟體比等均無(wú)明顯損害,未觀察到有害作用劑量為15.00 g/kg BW。研究對(duì)黃芪莖葉的急性毒性,三項(xiàng)遺傳及90 d亞慢性毒性做了整體評(píng)價(jià),為黃芪莖葉的安全性食用提供了科學(xué)數(shù)據(jù),有助于黃芪的全株綜合利用研究與綜合應(yīng)用,支撐黃芪產(chǎn)業(yè)的全鏈條和高質(zhì)量開(kāi)發(fā)。

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