基于曠場實驗探究二十味沉香丸對卒中后PTSD模型大鼠的調節(jié)作用*

李姝蒙，劉忠瀚，殷曉輝，俞 邦，朱泠霏，武慧超，毛 萌△

1北京中醫(yī)藥大學，北京100029;2首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院

腦卒中（cerebral stroke，CS）是由腦血管破裂或阻塞，導致局部神經(jīng)組織損傷而引發(fā)神經(jīng)功能障礙的一類疾病。該病通常包括腦出血、腦梗死、蛛網(wǎng)膜下腔出血等在內，具有高死亡率、高發(fā)病率、高復發(fā)率及高致殘率等特點［1］。創(chuàng)傷后應激障礙（post traumatic stress disorder，PTSD）是經(jīng)歷異乎尋常的災難性心理創(chuàng)傷事件（如嚴重車禍、戰(zhàn)爭、地震等），繼發(fā)出現(xiàn)的一種普遍性與復雜性的精神類疾?。?］。其主要癥狀包括創(chuàng)傷事件的再體驗、回避反應及高警覺狀態(tài)等［3］。腦卒中本身對患者生活及心理造成巨大影響，并具有不可預見的特點，足以成為引起PTSD的內在應激原，引發(fā)患者出現(xiàn)與尋常PTSD十分類似的臨床表現(xiàn)。前期研究顯示，腦中動脈線栓法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模后動物出現(xiàn)了一定的PTSD狀態(tài)［4］。所以項目組在MCAO造模后篩選符合要求的模型動物為最終入組的實驗動物，從而復制卒中后PTSD模型。

藏藥中“二十味沉香丸”是由阿旺白桑［5］在“八味沉香丸”的基礎上，添加紅花、珍珠母、牛黃、降香等二十味藥而成，收載于其所著的《驗方集萃》中。該方具有調和氣血、安神鎮(zhèn)靜、化瘀止痛的功效。研究表明，其對卒中后肢體運動及精神障礙有良好的治療效果，可調理精神、意識、思維等。二十味沉香丸以治療卒中為本，“調隆”以調情志，其特殊的炮炙方法還可降低毒性，提高藥效。張濤等［6］研究發(fā)現(xiàn)帕羅西汀聯(lián)合二十味沉香丸可快速改焦慮癥患者癥狀，提高治愈率。由此可見，二十味沉香丸治療卒中后PTSD具有一定優(yōu)勢。近年來，筆者就二十味沉香丸對卒中后PTSD的作用效果進行了研究，將從新的領域和途徑，為卒中患者常見的精神共病提供治療思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇雄性Wistar大鼠42只，體質量（200±20）g，購自斯貝福實驗動物科技有限公司（北京），實驗動物許可證號：SYXK（京）2019-0030，并適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗藥品二十味沉香丸（西藏甘露藏藥股份有限公司，批號：17063A，規(guī)格：56 mg/丸）。組成及比例依據(jù)藏醫(yī)學家阿旺白桑所著的《驗方集萃》［5］，藥物組成：沉香、廣棗、天竺黃、牛黃、兔心紅花、馬錢子、乳香、石決明、紫檀香、肉豆蔻、鹿茸、木香、丁香、訶子、余甘子等20味藥。用生理鹽水配成0.072 g/mL的懸濁液。灌胃按照按照每1 mL/100 g體質量給藥。帕羅西?。ㄕ憬A海藥業(yè)股份有限公司，批號：1354E18031，規(guī)格：20 mg/片），使用生理水配置成0.045 g/mL的懸濁液。藥物配成后分裝并密封，置于4℃冰箱中備用。灌胃按照每1 mL/100 g給藥。

1.3 儀器設備木質曠場箱由北京中醫(yī)藥大學行為學實驗室提供。行為學分析系統(tǒng)（Nodule公司）包括計算機、攝像頭以及行為學分析軟件。

1.4 模型制備采用MCAO［4］建立局灶性腦缺血模型大鼠模型。1）栓線制備：用長約40 mm，直徑為0.23 mm的魚線，砂紙細磨頭端使之變鈍，頭端涂清漆，處理后頭端變圓鈍，直徑約0.26～0.28 mm，在距此頭端10、18、20 mm處分別作標記。酒精擦洗后37℃烤箱烤干，無菌保存?zhèn)溆谩?）模型制備：Wistar大鼠禁食12 h后，天秤稱取動物體質量，稀釋為10%的水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉動物。麻醉后仰臥位固定于手術臺上，消毒備皮。經(jīng)頸部正中切開皮膚，切口約2.5 cm，鈍性分離肌肉及皮下組織，暴露頸總動脈（common carotid artery，CCA），注意不要損傷迷走神經(jīng)，切忌鉗夾。然后沿CCA向上分離頸外動脈（external carotid artery，ECA）和 頸 內 動 脈（internal carotid artery，ICA），結扎CCA、ECA，于CCA近分叉處剪一小口，經(jīng)切口插入制備好的栓線（預先蘸少許肝素鈉溶液抗凝），微遇阻力時停止，進線深度約為18～20 mm。如栓線進入血管約10 mm后再進困難，調整栓線角度后仍不能進入，則游離出ICA顱外唯一分支大腦腳穿動脈（perforator artery of cerebral peduncle，PPA），并在PPA的起始部置一血管夾，以防止栓線進入PPA。栓線經(jīng)過CCA分叉處、ICA進入顱底至較細的大腦前動脈（anterior cerebral artery，ACA），以阻斷來源于同側頸內動脈、大腦前動脈及大腦后動脈的血流供應，即完成對右側大腦中動脈（middle cerebral arteries，MCA）的阻塞［6］。撤掉PPA處的血管夾，固定栓子后逐層縫合皮膚。清除術野，關閉切口。術后動物分組分籠飼養(yǎng)，不禁食水，室溫控制在25℃左右。假手術組只分離血管，不阻斷血流。腦中動脈線栓法造模后參照LONGA等［7］的大鼠神經(jīng)行為學評分法，篩選符合要求的模型動物。

1.5 分組及給藥1）將大鼠進行卒中后PTSD造模，隨機分為5組，正常組、假手術組每組各6只，模型組、二十味沉香丸組、帕羅西汀組每組各10只。造模后篩選符合要求的模型動物為最終入組的實驗動物，重新進行隨機分組，最終正常組、假手術組、模型組、二十味沉香丸組及帕羅西汀組每組各6只。2）經(jīng)過適應性飼養(yǎng)后，將各組動物每晚19∶00進行灌胃，灌胃前將二十味沉香丸懸濁液及帕羅西汀懸濁液搖勻。正常組、假手術組、模型組給予1 mL/100 g生理鹽水灌胃，二十味沉香丸組給予1 mL/100 g二十味沉香丸懸濁液灌胃，帕羅西汀組給予1 mL/100 g帕羅西汀懸濁液灌胃，連續(xù)灌胃2周。

1.6 觀察指標曠場實驗采用立方形灰色木質曠場箱，長100 cm，高100 cm，高45 cm，曠場箱底部用黑線劃分出25個正方形格（20 cm×20 cm），攝像頭置于曠場箱正上方。實驗時將動物放入箱內底面中央格，開始進行5 min錄像，錄像過程中實驗人員著黑衣，且避免來回走動。觀察記錄大鼠直立次數(shù)、直立時間、修飾次數(shù)及修飾時間。每次實驗結束后用酒精清洗方箱內部，以免上一只大鼠留下的氣味影響下次測試。錄像結束后采用計算機軟件對錄像進行分析，測得每組大鼠5 min內運動總距離、穿格次數(shù)、單次最大運動距離、中央?yún)^(qū)停留時間等指標。

1.7 統(tǒng)計學方法使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s描述，若資料類型為正態(tài)分布時，采用單因素方差分析進行組間比較；若為偏態(tài)分布的資料，采用秩和檢驗進行組間比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 曠場實驗測試運動總距離、穿格次數(shù)，模型組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；運動總距離、穿格次數(shù)、直立次數(shù)、直立時間、修飾次數(shù)及修飾時間，模型組與假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；運動總距離、穿格次數(shù)、直立次數(shù)及直立時間，二十味沉香丸組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；運動總距離、穿格次數(shù)及直立次數(shù)，帕羅西汀組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1—2。

表1 各組大鼠曠場實驗水平指標比較（±s）

表1 各組大鼠曠場實驗水平指標比較（±s）

注：與正常組比較，b表示P＜0.01；與假手術組比較，d表示P＜0.01；與模型組比較，e表示P＜0.05

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2.2 曠場實驗運動軌跡相較于正常組及假手術組，模型組自主運動活性顯著降低，活動僅局限在箱內底面中央格到角落；相較于模型組，二十味沉香丸組自主運動顯著增加，活動集中在邊角部位且與帕羅西汀組無明顯差異。見圖1。

表2 各組大鼠曠場實驗垂直指標比較（±s）

表2 各組大鼠曠場實驗垂直指標比較（±s）

注：與正常組比較，a表示P＜0.05；與假手術組比較，c表示P＜0.05；與模型組比較，e表示P＜0.05，f表示P＜0.01

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圖1 各組大鼠曠場實驗運動軌跡

3 討論

腦卒中作為全球第二大、中國第一大致死性疾病，嚴重影響患者的身體健康和生活質量。臨床中，腦卒中患者大多伴有不同程度的精神障礙［8-9］，而卒中后PTSD并未受到足夠的重視。有數(shù)據(jù)顯示［10］，在無明顯意識狀態(tài)下的腦卒中患者腦卒中3～4周內PTSD的發(fā)生率為80.9%。有文獻顯示［11］，女性患者的發(fā)病率更高。相較其他卒中后的精神障礙，PTSD與卒中發(fā)生的次數(shù)、消極事件等關系更為密切，且有不易隨時間而減輕的特點［12-13］。卒中后PTSD發(fā)病后遷延難愈，對患者及家屬造成嚴重損傷，然而國內對卒中后PTSD的治療研究較少，其病機與治療仍在進一步的探索中。

目前，MCAO是公認的較為理想的制備大腦中動脈缺血的方法，能有效模擬缺血性腦卒中癥狀。且本團隊前期研究［5］顯示，MCAO造模后造成了一定的PTSD狀態(tài)。所以項目組MCAO造模后篩選符合要求的模型動物為最終入組的實驗動物，從而復制卒中后PTSD模型。

曠場實驗通過檢測大鼠在自然狀態(tài)下的運動情況，能較好地反映出動物的焦慮水平。故本研究采用曠場實驗作為評價造模成功與否及藥物作用效果的指標。既往研究表明，五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再攝取抑制劑帕羅西汀對PTSD有較好的治療效果，且對卒中后精神障礙類疾病也具有一定的治療作用，因而本研究采用帕羅西汀作為陽性對照藥物。

本研究結果表明，模型組大鼠運動總距離、穿格次數(shù)較正常組減少；模型組大鼠穿格次數(shù)、運動總距離、直立次數(shù)、直立時間、修飾次數(shù)及修飾時間較假手術組減少，提示模型組大鼠焦慮樣行為增加，提示模型成功復制。二十味沉香丸組運動總距離、穿格次數(shù)、直立時間及直立次數(shù)較模型組增加，提示使用二十味沉香丸在一定程度上能有效改善卒中后PTSD模型大鼠的焦慮樣行為；帕羅西汀組大鼠穿格次數(shù)、運動總距離、直立次數(shù)較模型組增加，提示帕羅西汀對卒中后PTSD有一定的治療作用。

本研究通過實驗表明，二十味沉香丸對卒中后PTSD大鼠的行為學異常具有一定的改善作用，將二十味沉香丸運用于卒中后PTSD的動物實驗以進一步研究其治療機制，將從新的領域和途徑，為卒中患者常見的精神共病提供治療思路，也將為卒中后PTSD的臨床治療提供更多的實驗基礎。