基于網(wǎng)絡藥理學探討桑貝止嗽散治療新型冠狀病毒肺炎的作用機制*

龍遠雄，歐陽林旗，房 赤，彭 俊，王勝玫，陳 鎮(zhèn)，陳新宇，鄧桂明

湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007

新型冠狀病毒肺炎新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）（簡稱新冠肺炎）［1］是一種經(jīng)呼吸道傳播的新型傳染病，目前臨床上尚未發(fā)現(xiàn)特效治療藥物。中醫(yī)將其歸屬為“疫病”范疇［2］，國醫(yī)大師熊繼柏認為此次新冠肺炎屬于溫熱濁毒之癘氣引起的疫病，并將病程分為輕癥期、重癥期、危重期、恢復期，在其牽頭制定的《湖南省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)藥診療方案（試行）第三版》中，推薦使用桑貝止嗽散、桑菊飲、銀翹散、霍樸夏苓湯方劑治療新冠肺炎不同時期患者。其中桑貝止嗽散主要用于初熱期咳嗽微喘型患者的治療，組方為桑貝散合止嗽散，藥物組成：桑白皮、浙貝母、百部、紫菀、白前、桔梗、荊芥、陳皮、苦杏仁、甘草，本方中百部、紫菀為原止嗽散兩味君藥，桑白皮、浙貝母為桑貝散的核心藥對［3-5］。本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法篩選桑貝止嗽散中4味核心藥物的有效成分，運用TCMSP、GeneCards等數(shù)據(jù)庫收集其治療新冠肺炎的相關靶點，構建“活性成分-靶點”和蛋白互作網(wǎng)絡，分析其作用功能通路，為進一步開展桑貝止嗽散藥理機理和臨床推廣提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 桑貝止嗽散核心藥物活性化合物提取篩選本研究通過中藥網(wǎng)絡藥理學平臺檢索桑白皮、浙貝母、百部、紫菀四味核心藥物的化學成分，并以口服吸收利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18為篩選條件，提取各味中藥的主要活性化合物。

1.2 桑貝止嗽散核心藥物治療新型冠狀病毒肺炎靶點預測利用TCMSP數(shù)據(jù)庫通過化合物MOL-ID編號檢索其作用靶標，并通過Uniport數(shù)據(jù)庫檢索各靶點對應的基因名；基于GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“viral pneumonia”為關鍵詞檢索與新型冠狀病毒肺炎相關的基因，并與藥物活性化合物靶點取交集，得到桑貝止嗽散核心藥物治療新冠肺炎的作用靶點。

1.3 “活性化合物-作用靶點”網(wǎng)絡構建與分析將

桑貝止嗽散核心藥物活性化合物及其作用于新冠肺炎的相關靶點導入Cytoscape3.7.1軟件中，并利用“Network Analyzer”功能對中藥化學成分-作用靶點網(wǎng)絡進行分析。根據(jù)化合物與靶點連接情況篩選出桑貝止嗽散核心藥物對作用于新冠肺炎的關鍵化合物。

1.4 蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建及關鍵靶點篩選將交集靶點導入STING數(shù)據(jù)庫中，限定研究物種為人類，得到桑貝止嗽散核心藥物作用于新冠肺炎的PPI網(wǎng)絡。借助Cytoscape軟件對網(wǎng)絡進行拓撲分析，選取度（Degree），介數(shù)（betweenness）和中心性（closeness）都大于平均值的靶點為關鍵靶點。度（degree）值為某節(jié)點直接相連的節(jié)點數(shù)，值越大，說明與其發(fā)生關聯(lián)的節(jié)點越多，該節(jié)點越重要；介度（betweenness）指的是圖中有路徑相連的兩個節(jié)點這樣的邊中有多少條邊經(jīng)過本節(jié)點；中心性（closeness）計算的是節(jié)點處于圖中間位置的程度。這三個值共同決定某節(jié)點關鍵程度，值越大，越關鍵。

1.5 靶點GO功能分析KEGG通路分析為進一步了解核心靶點基因功能和桑貝止嗽散核心藥物治療新冠肺炎的主要作用通路，將藥物與疾病相關靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，選定物種為“homo sapiens”，設定閾值P＜0.05進行GO和KEGG分析，用R語言進行可視化處理。

2 結果

2.1 桑貝止嗽散核心藥物主要活性化合物及對應靶標本研究通過TCMSP平臺檢索桑貝止嗽散4味君藥包含的主要化合物，依據(jù)OB≥30%，DL≥0.18共篩選出主要活性化合物82個，其中桑白皮24個、浙貝母7個、百部32個、紫菀19個。去掉重復值后共78個活性化合物，再通過各化合物molecule-ID尋找對相應的靶點，得到各藥物靶點總數(shù)997個，去重后靶點數(shù)148個靶點。

2.2 桑貝止嗽散核心藥物治療新型冠狀病毒肺炎疾病靶點預測在Genecards數(shù)據(jù)庫中以“viral pneumonia”作為關鍵詞進行檢索，得到與新型冠狀病毒肺炎相關的基因，將篩選得到的藥物靶點與疾病靶點進行映射，獲得桑貝止嗽散核心藥物治療新冠肺炎的潛在作用靶點。通過數(shù)據(jù)庫收集整理得到的新冠肺炎疾病相關基因共有3473個，通過與桑貝止嗽散核心藥物活性化合物的潛在靶標取交集分析后，共發(fā)現(xiàn)87個桑貝止嗽散核心藥物靶點與新冠肺炎疾病相關，交集靶點見表1。

表1 桑貝止嗽散治療新型冠狀病毒肺炎疾病靶點

2.3 活性化合物-疾病靶點網(wǎng)絡構建與分析在桑貝止嗽散4味核心藥物78個有效化合物中作用的靶點中，通過與GeneCards數(shù)據(jù)庫中3473個新冠肺炎相關靶基因進行比對，其中交集基因數(shù)87個，對應有效化合物68個，借助軟件Cytocsape 3.7.1構建中藥化合物-靶點網(wǎng)絡，見圖1。圖1中，紅色矩形代表有效成分節(jié)點，綠色菱形代表靶點節(jié)點，形狀越大，表示度（degree）越大。

圖1 中1度（degree）≥20的化合物共8個，度數(shù)最高的化合物為quercetin，其次為kaempferol、luteolin、beta-sitosterol、Stigmasterol、7-methoxy-3-methyl-2，5-dihydroxy-9，10-dihydrophenanthrene、formononetin、isorhamnetin，這些度值較高的化合物可能是桑貝止嗽散核心藥物治療新冠肺炎的關鍵化合物。見表2。

表2 桑貝止嗽散核心治療藥物與新冠肺炎關鍵化合物（Degree≥20）

圖1 有效化合物-作用靶點圖

2.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡構建與關鍵靶點篩選將藥物-疾病交集靶點（87個）Cytoscape軟件進行拓撲分析，選取自由度（Degree），介數(shù)（Betweenness）和中心性（Closeness）都大于平均值的靶點為關鍵靶點。網(wǎng)絡中各節(jié)點的平均自由度為18.96，平均介數(shù)為88.51，平均中心度數(shù)為0.51，自由度、介數(shù)、中心度數(shù)均超過平均值的靶點有17個，見表3。推測這些靶點可能是桑貝止嗽散治療新冠肺炎的關鍵靶。同時將結果導入STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白相互作用（PPI）分析，限定研究物種為“人”，得到桑貝止嗽散核心藥物用于新冠肺炎的PPI網(wǎng)絡，見圖2。

表3 桑貝止嗽散核心藥物治療新型冠狀病毒肺炎疾病的關鍵靶點

圖2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡圖

2.5 GO功能富集分析將藥物-疾病交集基因導入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“Homo Sapiens”，設定閾值P＜0.05，進行GO功能分析和基于KEGG通路富集分析。結果顯示87個基因共影響110個生物學過程（其中生物進程BP 67個，細胞組分過程CC17個，分子功能過程MF26個），富集顯著程度排名前15的生物過程見表4，表中PValue值越小，表示富集程度越顯著，用R軟件進行可視化展示，見圖3。

表4 靶點GO分析結果（部分）

圖3 靶點GO富集分析柱狀圖

2.6 KEEG通路分析87個交集靶點基因富集于14條通路上（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05），其中有5條通路新型冠狀病毒肺炎密切相關，見表5。主要包括PI3K-Akt信號通路，鈣離子信號通路，T細胞受體信號轉導，TNF信號通路，VEGF信號通路，提示桑貝止嗽散核心藥物可能通過作用以上多條通路來發(fā)揮治療（初熱期咳嗽微喘型）新冠肺炎作用機制。

表5 靶點KEGG分析結果

3 討論

新冠肺炎因其傳染性強、傳播迅速，歸屬于中醫(yī)“疫病”范疇，患者為感受疫癘之氣，病位在肺，病性特點為“濕熱濁毒”，事實證明中醫(yī)藥對其有較好的治療效果［6］。桑貝止嗽散作為宣肺止咳的良藥，被《湖南省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)藥中醫(yī)藥診療方案（試行第三版）》推薦使用，主要治療新冠肺炎發(fā)熱初期咳嗽微喘型患者。該方主要由止嗽散和桑貝散組成，方中桑白皮和貝母具有平喘功效，紫菀、百部可止咳化痰，諸藥相配，共奏止嗽化痰，宣肺平喘之功［5］。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學原理共篩選桑貝止嗽散中4味核心藥物（桑白皮、紫菀、浙貝母、百部）活性化合物78個，作用靶點148個，其中作用于新冠肺炎的有效化合物68個、靶點87個，說明桑貝止嗽散治療新冠肺炎具有多成分、多靶點的特點。通過“活性化合物-靶點”網(wǎng)絡進行分析，篩選出Degree≥20的關鍵活性化合物8個。度值最大的為槲皮素，槲皮素本身具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用，能有效改善肺損傷情況，同時也能降低TGF-β1、TNF-α和α-SMA活性、抑制細胞凋亡及降低細胞炎癥因子釋放，從而抑制細胞凋亡降低炎癥水平［7-8］；山奈酚是MHF的主要活性成分，與槲皮素能夠與2019-nCoV3CL水解酶、ACE2完成較好的對接，從而起到治療的效果［9］；木犀草素是一種黃酮類化合物，臨床主要用于消炎止咳、祛痰平喘等，具有消炎、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理作用，能通過免疫調節(jié)抑制大腸埃希菌（導致肺炎的常見菌株）對呼吸道上皮細胞的感染［10-11］；β-谷甾醇和豆甾醇是常見的植物甾醇，兩者均具有抗氧化、抗炎、免疫調節(jié)、抗腫瘤和調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用［12］；芒柄花素是一種能治療肺炎、調節(jié)機體免疫功能的活性成分，可以通過結合人體ACE2受體阻斷病毒的入侵，具有潛在抗SARSCoV-2活性［13］；7-甲氧基-3-甲基-2，5-二羥基-9，10-二氫菲能夠作用于ADRB2、AR、CCNA2等23個與新冠肺炎相關的靶標，從而達到治療目的；異鼠李堿能夠通過MAPK和NF-KB的信號通路對LPS誘發(fā)的急性肺損傷起保護性的作用［14-15］。

蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡中篩選后，Degree＞40的靶點有9個：腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血 管 內 皮 生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、細胞腫瘤抗原（tumor protein p53，TP53）、表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、JUN激酶（Jun kinase，JUN）、前列素內環(huán)氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶8（recombinant mitogen activated protein kinase 8，MAPK8）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。TNF在維持細胞、組織和生物體內的穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用，參與機體炎癥反應與免疫反應，可以調節(jié)炎癥反應［16］。VEGFA具有改善血管通透性、促進血管內皮細胞分裂的作用。有研宄表明VEGFA基因與肺癌的發(fā)病風險具有相關性［17］。TP53是一種抑癌基因，其關鍵功能是修復DNA損傷，在調控細胞周期、細胞凋亡和維持基因組穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著重要作用，與非小細胞肺癌密切相關［18］。EGF能促進多種組織的表皮細胞增殖、分化和修復，對促進高血壓和肺血管病變的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要作用。JUN能夠促使MAPK（蛋白激酶）發(fā)生信號轉導級聯(lián)反應，調節(jié)特定的基因表達，參與細胞凋亡，對急性炎癥反應具有調節(jié)作用［19］。研究表明，PTGS2在影響RNA病毒的復制以及在治療肺炎的過程中起關鍵作用。MAPK1和MAPK8屬MAPK家族，MAPK的通路亞家族包括細胞外信號調節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）和p38等，它們參與細胞增殖、分化、凋亡和炎癥。表皮生長因子受體（EGFR）信號傳導的肺損傷會引起肺纖維化，而抑制EGFR信號反應可以防止SARS及其他呼吸道病毒感染肺部纖維化的反應，EGFR突變是非小細胞肺癌患者最常見的靶基因異常［18］。

GO功能富集分析結果表明，桑貝止嗽散作用于新冠肺炎的生物過程主要涉及蛋白表達、信號通路傳導、炎癥反應等110個，其中脂多糖介導的信號通路、細胞外間隙、蛋白信號轉導、缺氧反應、基因表達的負調控、血紅素結合等生物過程在治療新冠肺炎中可能發(fā)揮關鍵作用。KEGG通路分析結果顯示，桑貝止嗽散治療新冠肺炎的潛在作用靶點主要涉及PI3K-Akt信號通路，鈣離子信號通路，多巴胺能突觸等6條，涵蓋病毒、免疫調節(jié)、炎癥等各個方面，通路上富集靶點越多，發(fā)揮的作用可能越大。本研究中PI3K-Akt信號通路富集靶點數(shù)最多，說明其作用最為關鍵，PI3K-Akt信號通路參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節(jié)，已有研究表明PI3K信號通路在調控重癥肺Treg/Th17平衡中的能發(fā)揮重要作用［20-22］；其次富集靶點數(shù)較多通路還有鈣離子信號通路、T細胞受體信號轉導等，說明桑貝止嗽散可能通過作用于這些通路的相關靶點發(fā)揮治療作用。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法從理論分析得到桑貝止嗽散核心藥物治療新冠肺炎的關鍵化合物及其作用的潛在靶點、影響的生物功能過程和通路，同時也得出桑貝止嗽散治療新冠肺炎是多成分、多靶點、多途徑相互作用的結果，可以為臨床提供理論依據(jù)，但其作用機制還需通過實驗研究驗證。