雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)的構建與驗證

王旭輝，周 倩，凌小敏，劉軍建，康立山，顧春銀

(信達生物制藥(蘇州)有限公司 新藥研究部，江蘇 蘇州 215123)

近年來，體外展示技術如噬菌體展示、酵母展示在單克隆抗體或融合蛋白藥物的發(fā)現(xiàn)與工程改造中得到廣泛應用[1-6]。體外展示技術獲得的候選分子，具有豐富的結合表位及種屬交叉性，經(jīng)過抗體的親和力成熟，可獲得更高親和力的抗體分子[7]。與噬菌體展示相比，酵母是真核生物，具有翻譯后修飾的能力；同時結合流式細胞熒光分選(簡稱流式分選)技術實時可見的特點，酵母展示在抗體親和力成熟中具有更顯著的優(yōu)勢[4]。但傳統(tǒng)酵母展示技術只將特定蛋白展示于表面[1-3]，無法同時將抗體分泌至培養(yǎng)基上清以用于親和力測定；需要在哺乳動物細胞體系中表達、純化，獲得蛋白樣品后方能進行親和力測定，在通量、成本、周期上存在瓶頸。

雖已有文獻提出了多種解決方案，但均存在一定的局限性。如，將酵母細胞分泌的抗體重新捕獲進而展示于表面的技術[8]，存在基因型與表型不能有效保持一致的風險；盡管通過使用黏性緩沖液與避免劇烈振動可以降低風險，但操作上技術難度很大，使得此方法不具備通用性。此外，2015年Adimab公司報道了一種經(jīng)過改造的釀酒酵母，可在特定條件下利用人工合成氨基酸翻譯終止密碼子UAG，進而實現(xiàn)展示與分泌的切換[9]，但由于UAG翻譯效率的限制，使得抗體在酵母細胞表面展示的豐度大大下降，影響了文庫的篩選效率。Glycofi公司將抗體可結晶片斷(Fc)區(qū)域與錨定蛋白連接展示于畢赤酵母表面，通過Fc間的相互作用實現(xiàn)抗體半分子的展示，同時，完整的抗體分子可以分泌至培養(yǎng)基中[10]，實現(xiàn)了展示與分泌同時完成的目的。但此技術使用畢赤酵母作為展示菌株，需要將文庫插入畢赤酵母基因組中，限制了文庫構建時的多樣性。此外，F(xiàn)c的分子量及形成同源二聚體等因素影響了抗體的展示效果。因此，本研究針對Fc進一步優(yōu)化并將此系統(tǒng)移植至釀酒酵母，以開發(fā)適用于釀酒酵母、展示效率更高的雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)。

本研究基于Fc展示抗體的方法[10]，針對Fc進一步優(yōu)化，比較重鏈恒定區(qū)3T366W突變(CH3Knob)、不同長度的Fc區(qū)域作為展示單元，對抗體展示與分泌效果的影響。最終，選定了CH3Knob作為展示單元，CH3Knob展示于酵母細胞表面作為“誘餌”結合含F(xiàn)cHole(Hole突變：T366S、L368A、Y407A)的抗體半分子；同時，含F(xiàn)cHole的抗體半分子可以形成同源二聚體，該完整的抗體分子分泌至培養(yǎng)基中，達到展示與分泌兼具的效果，并命名為雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)。此系統(tǒng)使用更小的CH3Knob作為“誘餌”，降低了CH3Knob間形成同源二聚體的比例，使得抗體的展示效率更高[11]。雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)經(jīng)模擬文庫驗證，可高效篩選出占比僅0.01%的高親和力菌株，滿足親和力成熟文庫的篩選需要；并且，篩選出的高親和力菌株將抗體同時分泌至培養(yǎng)基上清液，可直接使用上清液進行親和力測定。結果充分說明雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)搭建成功并可用于抗體的親和力成熟改造中，從而顯著提高工作效率、縮短抗體親和力成熟的周期。

1 材料與方法

1.1 試劑、菌株、質粒與轉化

引物、基因DNA片段由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；分子克隆、酵母細胞培養(yǎng)基等材料，大連寶生物公司；生物素化的PD-L1，Acrobiosystems公司；Mouse Anti V5-FITC，Invitrogen公司；Mouse Anti Human IgG-APC，Biolegend公司；Mouse Anti Flag M2，Sigma公司；Streptavidin-PE、Goat anti-Mouse-Alexa Fluor 647，Thermo Fisher公司；AHC傳感器，F(xiàn)orteBio公司；G418硫酸鹽、2 mL U型底96深孔板，生工生物工程(上海)股份有限公司；無機鹽等，國藥集團化學試劑有限公司。

本研究中所用菌株分別為釀酒酵母EBY100(ATCC)，IDY104通過插入URA3位點改造EBY100獲得(圖1)。根據(jù)文獻[11]所述方法，將基因片段PGAL1-CH3Knob-Flag-AGA2-TERMATα-PAgTEF-KanR轉化入EBY100；涂布于含200 μg/mL G418抗性的YPD平板，30 ℃培養(yǎng)3 d獲得單克??；挑取多個單克隆用抗Flag標簽的抗體流式染色篩選，最終選擇Flag標簽展示比例最高的克隆命名為IDY104。

圖1 IDY104菌株改造示意

本研究所用質粒如表1所示，質粒pYDN001用于Aga2p與PD-L1胞外段融合展示；質粒pYDC039、pYDC040、pYDC041分別用于Aga2p與不同長度的Fc融合展示；質粒pYDC042、pYDC089用于針對PD-L1抗原的重鏈可變區(qū)(VHH)AmNB1613.36、HzNB1613與Fc融合的單域重鏈抗體的表達。pYDC099是在pYDC041的基礎上，將CH3Knob(T366W)突變成CH3WT；pYDC100是在pYDC042的基礎上，將CH3Hole(T366S、L368A、Y407V)突變成CH3WT；所有CH2區(qū)進行N297A突變去除N糖基化位點，避免酵母與哺乳動物糖基化差異造成干擾。

表1 質粒構建表

參照文獻[12]方法，將質粒按表2組合轉入相應菌株中，獲得轉化質粒的菌株涂布于相應營養(yǎng)缺陷型平板，30 ℃靜置培養(yǎng)3 d；挑取單克隆，接種于5 mL的相應營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基30 ℃、225 r/min培養(yǎng)過夜；菌液3 000 r/min離心3 min棄上清；加入5 mL YPGP誘導培養(yǎng)基(20 g/L半乳糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、5.4 g/L Na2HPO4、8.6 g/L NaH2PO4·H2O)重懸菌體；20 ℃、225 r/min分別誘導24和72 h；誘導24 h樣品收集細胞用于后續(xù)流式分析，誘導72 h樣品收集培養(yǎng)上清液用于后續(xù)實驗。

表2 釀酒酵母質粒轉化表

1.2 酵母細胞流式分析與分選

將表2中組1～5菌株被誘導24 h后的細胞用PD-L1抗原染色，比較抗PD-L1抗體在釀酒酵母細胞表面的展示水平，具體步驟如下：① 取1×106個細胞，用1 mL 1×PBSA (1×PBS+1%BSA)洗滌1次，3 000 r/min離心3 min(以下離心均為此條件)棄上清液；②加入100 μL 100 nmol/L生物素化的PD-L1，室溫孵育30 min；③加入1 mL 1×PBSA，離心棄上清液；④加入100 μL經(jīng)1×PBSA稀釋的SA-PE(1∶ 200稀釋)，避光冰浴20 min；⑤加入1 mL 1×PBSA，離心棄上清液，再加入500 μL 1×PBSA重懸細胞，用BD 公司的Accuri C6檢測，F(xiàn)L2通道信號反映了釀酒酵母表面所展示的抗體水平。

將表2中組1～3菌株被誘導72 h后的上清液與展示PD-L1抗原的酵母細胞(表2中組7誘導24 h的細胞)染色，比較上清液中的抗體含量，具體步驟如下：①取1×107個展示PD-L1抗原的酵母細胞，用1 mL 1×PBSA洗滌1次，加入1 mL 1×PBSA重懸細胞；②以每孔100 μL 即1×106個細胞鋪于96孔U型深孔板，離心棄上清液；③取100 μL誘導72 h的上清液加入步驟2的96孔板中，室溫孵育30 min；④ 離心棄上清液，1 mL 1×PBSA洗滌1次；⑤ 加入100 μL經(jīng)1×PBSA稀釋的二級抗體稀釋液(Mouse Anti V5-FITC以1∶ 1000稀釋、Mouse Anti Human IgG-APC以1∶ 200稀釋)，避光冰浴20 min；⑥加入1 mL 1×PBSA洗滌1次，加入500 μL 1×PBSA重懸細胞，用BD公司的Accuri C6檢測分析，F(xiàn)L1通道信號反映了PD-L1抗原的展示水平，F(xiàn)L4通道信號反映了上清中抗體的含量。

將表2中組5與組6菌株誘導24 h的細胞，按1∶ 102、1∶ 104混合為1%模擬文庫、0.01%模擬文庫；組5、組6、1%模擬文庫、0.01%模擬文庫分別與抗原染色，具體步驟如下：①各取2×107個細胞，1 mL 1×PBSA洗滌1次；②加入100 μL 10 nmol/L生物素化的PD-L1，室溫孵育30 min；③1 mL 1×PBSA洗滌1次，加入100 μL經(jīng)1×PBSA稀釋的二級抗體稀釋液(SA-PE，Mouse Anti Human IgG-APC稀釋比例同上文)，冰上避光孵育20 min；④1 mL 1×PBSA洗滌1次，加入1 mL 1×PBSA重懸細胞；⑤各取50 μL用BD 公司的Accuri C6檢測，APC信號反映了釀酒酵母表面所展示的抗體水平，PE信號反映了展示抗體與抗原的結合強弱；⑥1%模擬文庫、0.01%模擬文庫剩余的細胞用Beckman公司的MoFlo XDP進行流式分選，篩選出CH3Knob陽性(APC信號)且與抗原結合(PE信號)較強的細胞群。

1.3 酵母上清樣品的親和力測定

參照文獻[12]的方法，采用生物膜層干涉(BLI)技術，對誘導72 h的酵母上清液樣品測定其抗體與抗原的平衡解離常數(shù)(KD)。采用ForteBio公司的Octet Red96儀器進行分析，步驟簡述如下：首先平衡基線120 s；然后將酵母上清液中抗體固化至AHC傳感器，將已固化的傳感器置于含100 nmol/L PD-L1的溶液中，結合時間100 s；之后將傳感器轉移至分析緩沖液解離至少2 min，分別測定結合及解離速率；實驗結果使用1∶ 1結合模型進行動力學分析。

2 結果與討論

2.1 雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)的開發(fā)

本研究基于Fc展示抗體的方法，開發(fā)出一種展示與分泌兼具的酵母展示系統(tǒng)(圖2)，即雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中，引入T366W突變的CH3Knob序列與Aga2p融合展示于酵母表面；展示的CH3Knob可作為“誘餌”結合含F(xiàn)cHole的抗體半分子，同時含F(xiàn)cHole的抗體半分子可形成同源二聚體，該完整的抗體分子分泌至培養(yǎng)基中，最終實現(xiàn)酵母抗體展示與分泌的雙重功能。

圖2 展示與分泌兼具的酵母展示系統(tǒng)示意

以抗人PD-L1的VHH(AmNB1613.36)為例，評估雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)的可行性；同時為了選出最適合酵母展示且分泌效果好的“誘餌”，構建了一系列展示質粒DKTHTCPPCP-CH2N297A-CH3Knob-Flag-Aga2p(pYDC039)、CH2N297A-CH3Knob-Flag-Aga2p(pYDC040)、CH3Knob-Flag-Aga2p(pYDC041)；分別與VHH(AmNB1613.36)-DKTHTCPPCP-CH2N297A-CH3hole(pYDC042)組合轉入釀酒酵母EBY100，如表2中組1～3所示。取誘導24 h的細胞，用生物素化的人PD-L1抗原染色，比較抗體AmNB1613.36的展示水平(圖3(a))；取誘導72 h的培養(yǎng)基上清液與展示人PD-L1的細胞(表2的組7)孵育染色，比較抗體的分泌水平，如圖3(b)所示。由圖3(a)可知：組3的抗體展示效果最優(yōu)，說明使用CH3Knob作為“誘餌”抗體的展示效果最好。由圖3(b)可知：組3分泌抗體的量為組1、2的10～20倍，說明使用CH3Knob作為“誘餌”抗體的分泌量最大。顯而易見，使用CH3Knob作為“誘餌”，雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)工作效果最好。

圖3 雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)的開發(fā)

為了證實引入CH3knob與CH3hole突變能有效減少CH3的同源二聚體形成，有助于CH3knob與CH3hole的異源二聚體形成，提高抗體的展示水平，比較了野生型與突變體組合在抗體展示水平的差異，構建了knob與hole相應的野生型質粒，按表2的組3和組4分別轉入EBY100；挑取單克隆接種培養(yǎng)過夜再誘導24 h，各取1×106個細胞用生物素化的人PD-L1抗原染色，如圖3(c)所示。比較CH3展示但不與抗原結合的部分占總CH3展示的比例，組3約為1.17%/(23%+1.17%)=4.8%，而組4為5.58%/(5.58%+12.9%)=30.2%，說明引入Knob與Hole突變組合使CH3的同源二聚體減少了約6倍。

2.2 展示菌株IDY104的構建

前文已確定CH3Knob作為“誘餌”最利于抗體的展示與分泌，其編碼基因(CH3Knob-Flag-Aga2p)可以質粒形式轉入菌株中，亦可整合插入菌株基因組中。相較于質粒形式，整合插入菌株基因組時基因更不易丟失，細胞展示的比例更高；同時可節(jié)省一個質粒的篩選標簽，以便于在質粒上構建抗體的輕、重鏈文庫使用。因此，將質粒pYDC041編碼基因及上、下游啟動子與終止子序列：PGAL1-CH3Knob-Flag-AGA2-TERMATα，與遺傳霉素抗性基因PAgTEF-KanR串聯(lián)，兩端各加上50個堿基的URA3基因的上、下游同源臂，轉入釀酒酵母EBY100取代URA3基因(圖1)。外源基因片段理化后細胞涂布于含200 μg/mL G418的YPD平板，30 ℃培養(yǎng)3 d獲得單克??；篩選在Ura缺陷型培養(yǎng)基上不生長，但可在YPD+G418抗性平板生長的單克??；挑取若干單克隆培養(yǎng)，再誘導細胞，用流式檢測CH3Knob-Flag在酵母表面展示的水平，如圖4(a)所示。由圖4(a)可知：2、6、7、8號克隆均能有效展示，其中7號克隆展示比例最高，用作后續(xù)實驗并命名為IDY104。

圖4 IDY104菌株的構建、鑒定并與EBY100比較

為比較質粒形式或整合插入菌株基因組形式對CH3Knob展示效率的影響，將質粒pYDC041轉入EBY100，與菌株IDY104比較CH3Knob的展示水平，如圖4(b)所示。由圖4(b)可知：IDY104展示CH3Knob的陽性比例為78.7%(>33.7%)；但每個細胞展示的分子數(shù)要少2～3倍，反映出的平均熒光信號強度(MFI)1.79×105<5.38×105。此外，為比較兩種形式對抗體展示效率的影響，表2中的組3、5誘導24 h的細胞與抗原染色，如圖4(c)所示；由圖4(c)可知：組5的抗體展示水平稍弱，Y軸的MFI：5 714<7 081。組3與組5的上清液用Octet Red96儀器檢測與人PD-L1的親和力，如圖4(d)所示。由圖4(d)可知：兩組上清樣品與其抗原的親和力沒有差別。綜合而言，兩組均能有效分泌與展示抗體，上清樣品均可用于親和力測定，由于IDY104菌株所需質粒更少，構建文庫時更為簡便，可用作后續(xù)項目的實驗菌株。

2.3 雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)的驗證

為驗證雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)及其在抗體親和力成熟中的應用，本研究將抗人PD-L1高、低的不同親和力分子AmNB1613.36、HzNB1613分別展示于IDY104，如表2中組5與組6；將兩種菌株細胞數(shù)按1∶ 100或1∶ 10 000比例混合，模擬親和力成熟文庫，論證雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)及其在抗體親和力成熟中的應用可行性。

由于HzNB1613、AmNB1613.36親和力強弱不同，在與10 nmol/L生物素化的PD-L1抗原染色時，親和力強的結合信號越強；將組5、組6兩種菌株按1∶ 102、1∶ 104混合成1%、0.01%的模擬文庫，篩選Y軸信號高的細胞群，如圖5(a)所示。經(jīng)過兩輪篩選，每一輪隨機挑取24個單克隆測序，兩個模擬文庫均有效富集了組5菌株(展示AmNB1613.36)，如圖5(b)所示。經(jīng)過兩輪流式分選，1%模擬文庫中AmNB1613.36占比達到100%，0.01%模擬文庫中AmNB1613.36占比達到92%，說明雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)可高效將高親和力突變體從文庫中篩選出來。將組5、組6菌株誘導72 h的培養(yǎng)基上清液用Octet Red96儀器檢測與抗原的親和力，如圖5(c)所示，兩者培養(yǎng)基上清液樣品均能測定與抗原的結合動力學參數(shù)。以上結果充分驗證了雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)及其在抗體親和力成熟中的應用可行性，從而顯著提高工作效率、縮短抗體親和力成熟的周期。

3 結論

本研究介紹了一種雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)，克服了傳統(tǒng)酵母展示無法表達抗體至上清液的缺點，應用于抗體的親和力改造，顯著縮短時間、降低成本。此系統(tǒng)以抗人PD-L1的VHH抗體(AmNB1613.36)為例，初步證明了雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)構建成功；通過1%、0.01%的模擬文庫進一步驗證，充分證實了雙功能酵母展示與分泌系統(tǒng)可用于抗體的親和力成熟中，從而顯著提高工作效率、縮短抗體親和力成熟的周期。