人參皂苷的生物法制備及研究進(jìn)展

趙 璐,夏玲珍,儲(chǔ)建林,何冰芳

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800;2.臺(tái)州市中心醫(yī)院(臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院),浙江 臺(tái)州 318000;3.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 211800)

人參被譽(yù)為“百草之王”,具有提高免疫力、緩解疲勞、補(bǔ)充精力、改善體質(zhì)和安神益智等多種顯著的藥用功效,也是重要的滋補(bǔ)劑、保健品和食品添加劑[1-2],一直作為名貴中藥材被國(guó)內(nèi)外廣泛使用。人參中含有多種人參皂苷、人參多糖和人參烯醇等藥用活性物質(zhì)。近年來,人參的相關(guān)產(chǎn)品也越來越多地被應(yīng)用于化妝品和健康飲料等方面[3-4]。

人參皂苷是一類三萜類化合物,是人參中的主要藥用成分。目前,已有超過150種天然人參皂苷從人參藥材各部位中被分離和鑒定出來[5]。人參皂苷在天然人參中含量較低,5～7年生的人參中的人參皂苷總含量?jī)H為2%;而一些容易被吸收并能發(fā)揮較高生物活性的稀有人參皂苷(如人參皂苷Rg3、Rg2、Rh2和CK等)的含量則更加低微,含量?jī)H有十萬分之一左右,直接提取非常困難。根據(jù)人參皂苷苷元的骨架不同,人參皂苷可分為齊墩果烷型和達(dá)瑪烷型兩大類。其中,達(dá)瑪烷型人參皂苷主要以原人參二醇(PPD)、原人參三醇(PPT)和擬人參皂苷為苷元,而齊墩果烷型人參皂苷則以齊墩果酸為苷元[5](圖1)。

圖1 不同類型的人參皂苷苷元[5]

人參皂苷具有抗癌、抗應(yīng)激和抗氧化等作用,也可用于糖尿病、心血管、免疫和神經(jīng)疾病的輔助治療[6]。人參皂苷化合物中糖基連接的位置和數(shù)量對(duì)其生物活性的影響顯著,例如:人參皂苷Rh2能抑制癌細(xì)胞向其他器官轉(zhuǎn)移[7];人參皂苷Rg1具有興奮中樞神經(jīng)和抑制血小板凝集的作用[8];人參皂苷Rg3能抑制癌細(xì)胞有絲分裂前期蛋白質(zhì)和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的合成,延緩癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)等[9-10]。目前,由人參皂苷Rg3制成的“參一膠囊”已成功作為藥品上市,用于培元固本、補(bǔ)益氣血,或與化療配合用藥,從而提高治療原發(fā)性肺癌、肝癌的功效,并且還能改善腫瘤患者的氣虛癥狀,提高機(jī)體免疫功能;人參皂苷CK具有保肝、抗炎和抗癌等功效,已被我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為防治關(guān)節(jié)炎的臨床用藥[11-12]。稀有人參皂苷CK、Rh2和Rg3等往往具有較強(qiáng)的藥理活性,但在天然植物中含量甚微,極為稀缺。因此,稀有人參皂苷的合成與獲取、制備方面的研究一直備受關(guān)注。

人參生長(zhǎng)緩慢,從幼苗到成熟階段通常需要5～7年,栽培種植時(shí)間較長(zhǎng)。另外,中藥材栽培技術(shù)相對(duì)復(fù)雜,易受季節(jié)、土壤、氣候和病蟲害等各種因素影響,難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模且高效穩(wěn)定的人工栽培。此外,人工栽培植株中人參皂苷的含量往往偏低(最高約為天然人參含量的1/3),難以滿足人參皂苷國(guó)內(nèi)外日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求[13]。為了解決藥源匱乏的問題,近年來國(guó)內(nèi)外研究者們致力于使用生物法制取人參皂苷產(chǎn)物,在組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因植物、生物合成途徑及合成生物學(xué)等各研究領(lǐng)域的生物技術(shù)上均取得了相應(yīng)進(jìn)展與突破,為大量制備或生產(chǎn)人參皂苷類產(chǎn)物奠定了重要的基礎(chǔ)。本文通過綜述人參皂苷的植物培養(yǎng)、合成途徑解析和合成生物學(xué)制備等方面的新進(jìn)展,特別是糖基轉(zhuǎn)移酶作為最后一步關(guān)鍵酶的相關(guān)研究,以期為稀有人參皂苷的生物法定向制備提供有關(guān)參考。

1 通過組織培養(yǎng)解決人參栽培難的問題

為了解決難以大量栽培人參組織的問題,在20世紀(jì)50年代,研究人員嘗試?yán)媒M織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來獲取人參皂苷成分,成功地培育出了人參根愈傷組織[14]。目前,利用懸浮細(xì)胞、不定根以及毛狀根的培養(yǎng)生產(chǎn)人參次生代謝產(chǎn)物是主要的研究方向。通常,人參的根系統(tǒng)在生長(zhǎng)速度、產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物含量等方面要優(yōu)于人參的其他組織細(xì)胞。因此,人參的根部培養(yǎng)是目前人參組織培養(yǎng)研究的主要熱點(diǎn)[15-16]。在培養(yǎng)規(guī)模方面,人參植物細(xì)胞培養(yǎng)已開發(fā)出固體靜止培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)等多種方式。不同的人參植物細(xì)胞培養(yǎng)方式需要建立適合的生物反應(yīng)器，以達(dá)到大量培養(yǎng)的目的,也是決定植物人參細(xì)胞能否實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。其中一個(gè)成功的例子是:韓國(guó)忠北大學(xué)利用了商業(yè)級(jí)鼓泡式生物反應(yīng)器建立的人參不定根擴(kuò)大培養(yǎng)系統(tǒng)，使人參細(xì)胞的培養(yǎng)規(guī)模高達(dá)10 000 L,年產(chǎn)人參不定根約45 t,獲得的人參皂苷產(chǎn)物可部分滿足韓國(guó)國(guó)內(nèi)保健品、藥品和化妝品等行業(yè)的市場(chǎng)需求[17-18]。

盡管人參的細(xì)胞培養(yǎng)和不定根培養(yǎng)均取得了一定的進(jìn)展,但仍然存在一些問題,如:繼代培養(yǎng)易退化或生長(zhǎng)減緩、人參皂苷含量較天然植株低，難以獲得高純度的高活性人參皂苷單體等。因此,人參的細(xì)胞培養(yǎng)還需要探索出易于培養(yǎng)且適合工業(yè)化生產(chǎn)的新方法。

2 通過轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)合成途徑關(guān)鍵酶的解析

由于人參皂苷在根、莖和葉等組織中累積與分布都不均勻,而人參特定根部組織中含有較多含量的人參皂苷,而一些活性較高成分如人參皂苷Rg3、Rh2等含量極其低微[5]。隨著人們對(duì)人參等植物遺傳信息的逐步認(rèn)識(shí),開始利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等方法研究人參中一些可能具備功能的基因,進(jìn)而通過遺傳學(xué)、基因工程技術(shù)方法獲得了轉(zhuǎn)基因人參,通過上調(diào)或下調(diào)人參皂苷生物合成過程中的相關(guān)基因，可獲得比人參植物組織細(xì)胞培養(yǎng)更高產(chǎn)量水平的人參皂苷類產(chǎn)物。例如:Lee等[19]研究了角鯊烯合酶在植物甾醇和三萜類化合物生物合成中的作用,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)角鯊烯合酶基因(PgSS1)在人參中過表達(dá),結(jié)果表明：過表達(dá)PgSS1的轉(zhuǎn)基因人參中伴隨著下游基因，如角鯊烯環(huán)氧酶、β-香樹素合酶和環(huán)阿屯醇酶的上調(diào),使得人參皂苷的含量明顯增加。由此可見,在轉(zhuǎn)基因人參中過表達(dá)角鯊烯合酶(PgSS1)、角鯊烯環(huán)氧酶基因(PgSQE1和PgSQE2)和細(xì)胞色素P450家族基因(CYP716A52v2和CYP716A53v2)等可能會(huì)提高人參皂苷的含量。但由于人參中次生代謝途徑眾多,轉(zhuǎn)基因人參細(xì)胞表達(dá)一些酶的特異性尚不夠,難以實(shí)現(xiàn)較為定向的人參皂苷生物合成調(diào)節(jié)。此外,轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定性與表達(dá)效率有待進(jìn)一步優(yōu)化,才能滿足人參皂苷單體與稀有人參皂苷的定向生物合成。

3 人參皂苷的合成生物學(xué)制備探索

3.1 人參皂苷的生物合成途徑解析

人們利用現(xiàn)代測(cè)序技術(shù),得到了人參全基因序列圖譜,從而對(duì)人參皂苷空間分布和人參組織層面的分子表達(dá)模式進(jìn)行了研究,關(guān)聯(lián)分析并篩選出潛在的合成人參皂苷的多個(gè)關(guān)鍵基因,闡述出人參皂苷可能的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制[17]。人參皂苷類植物的次生產(chǎn)物代謝主要通過甲羥戊酸(MVA)途徑和甲基赤蘚糖醇磷酸(MEP)途徑,在一系列酶的作用下,經(jīng)連續(xù)20多步的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)而形成[17，20]。涉及人參中三萜類物質(zhì)生物合成過程中起作用的關(guān)鍵酶，即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR),以及法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鯊烯合酶、鯊烯環(huán)氧酶、達(dá)瑪烷二醇合酶、香樹素合酶、細(xì)胞色素P450酶和糖基轉(zhuǎn)移酶等一系列酶類的有序協(xié)作催化。當(dāng)然,人參植物體內(nèi)也擁有著豐富的互補(bǔ)途徑,有利于三萜類人參皂苷產(chǎn)物合成的靈活調(diào)控。通常,在人參等植物中,人參皂苷三萜類化合物的生物合成主要有幾個(gè)關(guān)鍵步驟(圖2和3):異戊二烯單位3-異戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的生物合成,再由IPP和DMAPP衍生出法尼基二磷酸酯(FPP),兩個(gè)FPP頭對(duì)頭組裝，生成線性C30角鯊烯,進(jìn)一步生成重要中間體2,3-氧化鯊烯,最后經(jīng)過角鯊烯環(huán)化及多種官能團(tuán)修飾，生成具有不同羥基化位點(diǎn)的苷元物質(zhì),最后經(jīng)糖基化修飾形成數(shù)量眾多的人參皂苷產(chǎn)物[17]。

IPP和DMAPP的生物合成:IPP和DMAPP的產(chǎn)量水平對(duì)植物中人參皂苷的生物合成起著重要作用。人參中通常存在兩種主要的生物途徑可分別合成人參皂苷的重要前體物質(zhì)IPP和DMAPP:位于細(xì)胞質(zhì)的MVA途徑和位于質(zhì)體的MEP途徑(圖2)[20-21]。迄今為止,研究者認(rèn)為人參中主要優(yōu)先利用MVA途徑來產(chǎn)生IPP,關(guān)于人參的MVA途徑已有很多植物化學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)研究的報(bào)道[22-24]。然而,對(duì)于產(chǎn)生DMAPP的MEP途徑來說,其研究還處于初始階段。例如:Xu等[25]研究發(fā)現(xiàn)：人參基因組研究中存在MEP途徑轉(zhuǎn)錄組中間體,Xue等[26]對(duì)人參轉(zhuǎn)錄組的研究表明：與MEP途徑相關(guān)的基因主要在人參葉片中進(jìn)行表達(dá),其次是在側(cè)根或根皮中表達(dá),在莖和根中的表達(dá)量最低。MEP途徑和MVA途徑具有幾乎相同的轉(zhuǎn)錄豐度,表明MEP途徑在人參質(zhì)體或葉綠體組織中的人參皂苷生物合成中也起著重要作用。

MVA合成途徑以葡萄糖氧化生成的乙酰 CoA為起始。由圖2可知：先后在乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶(AACT)和3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(HMGS)作用下形成 3-羥基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA),接著在人參皂苷生物合成途徑中的第一個(gè)限速酶——HMGR的作用下合成MVA,依次在甲羥戊酸激酶(MVK)、二氧磷基甲羥戊酸激酶(PMK)和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MVD)的作用下生成IPP。MVA途徑生成的IPP可在異構(gòu)酶(IDI)的作用下形成DMAPP[27]。DMAPP也可以由MEP途徑生物合成:人參植物中存在的MEP途徑以葡萄糖經(jīng)糖酵解生成的3-磷酸甘油醛為起始先后在1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)作用下生成MEP,接著在2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶(IspD)、4-(胞苷-5-二磷酸)-2-C-甲基-赤蘚糖醇激酶(IspE)、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合酶(IspF)、4-羥基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸合酶(IspG)和4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶(IspH)等一系列酶的連續(xù)催化下合成DMAPP[26]。

圖2 MEP途徑和MVA合成途徑[26]

2,3氧化鯊烯的生物合成:MVA途徑產(chǎn)生的前體物質(zhì)IPP與異構(gòu)或經(jīng)MEP途徑產(chǎn)生的DMAPP在牻牛兒基焦磷酸合成酶(GPS)作用下，首先形成牻牛兒基焦磷酸(GPP)[28]。GPP和IPP由人參中的關(guān)鍵酶法尼基焦磷酸合成酶(FPS)催化形成FPP,FPS在三萜類人參皂苷化合物的生物合成中起著至關(guān)重要的作用。FPP再由鯊烯合成酶(SS)等酶的作用下合成鯊烯,鯊烯經(jīng)鯊烯環(huán)氧酶(SE)催化轉(zhuǎn)變?yōu)?,3-氧化鯊烯[28],該反應(yīng)步驟中鯊烯合成酶的活性大小對(duì)最終人參皂苷的產(chǎn)量起著重要的調(diào)節(jié)作用。

氧化鯊烯的環(huán)化及官能團(tuán)修飾:2,3-氧化鯊烯在不同酶的催化下衍生出多樣的環(huán)化產(chǎn)物,一方面若是經(jīng)環(huán)阿屯醇合酶(CAS)催化作用,可生成環(huán)阿屯醇；或在羊毛甾醇合酶(LAS)催化下，可生成羊毛甾醇,然后經(jīng)一系列生物合成反應(yīng)產(chǎn)生植物甾醇。另一方面若是達(dá)瑪烷二醇合成酶(DS)催化可生成達(dá)瑪烷二醇(dammarenediol),有研究表明：超表達(dá)DS可望顯著提高人參皂苷的產(chǎn)量,之后再經(jīng)細(xì)胞色素 P450 單加氧酶對(duì)人參中三萜類產(chǎn)物進(jìn)行氧化和羥基化作用得到人參皂苷苷元物質(zhì)[29]。最后,由糖基轉(zhuǎn)移酶等糖基化修飾后形成達(dá)瑪烷型人參皂苷；或是由β-香樹素合成酶(β-AS)的作用下合成β-香樹素,后經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶等催化作用，形成齊墩果烷型人參皂苷(圖3)[30]。

圖3 人參皂苷在植物體中的合成途徑[27]

3.2 人參皂苷生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶

在人參、三七和西洋參等人參屬植物中,數(shù)量豐富的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶類(UGTs)可催化原人參三醇/原人參二醇(PPT/PPD)的糖基化修飾,該步驟是人參皂苷生物合成途徑的最后一步,也是最為關(guān)鍵的一步,決定了最終生成的人參皂苷產(chǎn)物種類,進(jìn)而能影響其生物活性及功能用途[31]。藥理研究表明:人參皂苷苷元糖基化和修飾方式不同,形成的不同類型的人參皂苷可發(fā)揮不同的藥理作用[32-35]。人參中已發(fā)現(xiàn)并注釋220多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶,是人參基因組中最大基因家族之一。人參基因組在進(jìn)化過程中富集了大量的UGTs，決定著人參皂苷產(chǎn)物的多樣性。在人參植物中,不同糖基轉(zhuǎn)移酶可能具有不同的功能,表現(xiàn)在對(duì)多種苷元前體物質(zhì)的糖基化位點(diǎn)的選擇、糖基化程度等也不同,PPD型人參皂苷苷元的糖基化主要在C3和/或C20位點(diǎn),PPT型人參皂苷苷元的糖基化則主要在C6和/或C20位點(diǎn)。人參皂苷中糖苷鍵以O(shè)-糖苷鍵存在,且C3、C6位多糖結(jié)構(gòu)間多為β-1,2糖苷鍵,而C20的多糖結(jié)構(gòu)間位多為β-1,6糖苷鍵[5]。

人參、三七等植物中富含人參皂苷,且擁有相似的代謝途徑,一些UGTs的催化人參皂苷苷元的糖基化作用已經(jīng)闡明[36-37]。例如:人參中糖基轉(zhuǎn)移酶PgUGTPg100通過糖基化PPT的 C6位合成人參皂苷Rh1[38]；而在植物三七中的糖基轉(zhuǎn)移酶PnUGRdGT對(duì)人參皂苷Rd的C20位糖基化從而合成人參皂苷Rb1[39]。而人參中糖基轉(zhuǎn)移酶PgUGTPg1可以糖基化PPD形成人參皂苷Rh2、Rg3、CK、F2和Rd等產(chǎn)物[40]。人參中的糖基轉(zhuǎn)移酶PgUGTPg45可糖基化PPD 的C3—OH形成人參皂苷Rh2,而糖基轉(zhuǎn)移酶PgUGTPg29則可進(jìn)一步催化人參皂苷Rh2糖基化形成人參皂苷Rg3產(chǎn)物。這些人參、三七等植物來源糖基轉(zhuǎn)移酶的功能鑒定可為多種稀有人參皂苷的定向生物合成提供重要參考。

有意思的是,與植物來源的UGTs相比，只具有較低相似性的幾種微生物源的UGTs，也可以催化合成幾種人參皂苷產(chǎn)物,展現(xiàn)了一些微生物來源的糖基轉(zhuǎn)移酶在生物法制備稀有人參皂苷產(chǎn)物方面誘人的前景。 例如:枯草芽孢桿菌來源的BSGT1催化人參皂苷F1的C3位并合成了稀有的人參皂苷Ia(0.20 g/L)[41-42]。來源于枯草芽孢桿菌的UGT109A1，可將糖基化PPD和PPT的C3—OH和C12—OH,生成非天然人參皂苷產(chǎn)物。據(jù)報(bào)道,3β,12β-Di-O-Glc-PPD表現(xiàn)出比Rg3更高的抗肺癌活性[43]。同樣來源于枯草芽孢桿菌的Bs-YjiC對(duì)PPD和PPT均表現(xiàn)出很好的糖基化活性,生成Rh2、F12等人參皂苷產(chǎn)物[44-45]。

然而,大多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶具有“底物泛雜性”,導(dǎo)致其糖基化反應(yīng)較難應(yīng)用于定向生物合成特定的人參皂苷產(chǎn)物，特別是稀有人參皂苷CK、Rg3等。深入認(rèn)識(shí)與理解人參皂苷合成的糖基轉(zhuǎn)移酶,開展結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究，對(duì)高選擇性地獲得具有較高價(jià)值的稀有人參皂苷具有重要意義。對(duì)人參皂苷合成的最后一步關(guān)鍵酶——糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行篩選、高效表達(dá)與酶分子改造等研究,進(jìn)而耦聯(lián)優(yōu)化構(gòu)建的生物合成途徑,利用合成生物學(xué)構(gòu)建細(xì)胞工廠,有望實(shí)現(xiàn)稀有人參皂苷的高效定向生物合成。

3.3 人參酵母細(xì)胞工廠

為了解決天然產(chǎn)物含量極低、分離困難、提取成本高、難以大量制備獲取、收益低及不能滿足供需等一系列問題，在基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)上,對(duì)一些天然化合物的生物合成酶基因進(jìn)行表征與鑒定,在一些易于實(shí)現(xiàn)遺傳操作的底盤細(xì)胞中設(shè)計(jì)、裝配與集成以及重構(gòu)天然產(chǎn)物的代謝合成途徑,可更精確地控制目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成途徑,構(gòu)建出適合天然產(chǎn)物人工合成的細(xì)胞工廠。合成生物學(xué)是當(dāng)前最有前途的天然產(chǎn)物綠色環(huán)保制備技術(shù)之一,可以有效解決植物來源的稀有天然產(chǎn)物匱乏等問題。例如:釀酒酵母是廣泛用于食品和飲料生產(chǎn)的安全菌種,也是用于基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究的重要真核模式微生物。近年來,已經(jīng)通過合成生物學(xué)手段成功將釀酒酵母改造為多種生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物的細(xì)胞工廠,涉及的天然產(chǎn)物包括生物堿類、萜類[40]、黃酮類[46]和多酚類[47]等。此外,釀酒酵母具有膜定位和翻譯后修飾功能,可為植物和動(dòng)物來源的異源酶功能表達(dá)提供相似的物理和生理環(huán)境[48]?？梢娫诮湍傅妆P細(xì)胞中構(gòu)建完整的人參皂苷類產(chǎn)物的生物合成途徑是切實(shí)可行的。

近年來,對(duì)人參皂苷生物合成途徑的研究取得了一些進(jìn)展,為研究者們致力于利用合成生物學(xué)技術(shù)、構(gòu)建酵母細(xì)胞工廠來生產(chǎn)多種不同人參皂苷萜類成分奠定了基礎(chǔ)。Han等[49]克隆、表達(dá)并鑒定了PPD，合成途徑關(guān)鍵酶細(xì)胞色素P450(CYP716A47),構(gòu)建了可以生產(chǎn)PPD的酵母細(xì)胞,次年又鑒定出了細(xì)胞色素P450(CYP716A53v2)，可以催化原人參二醇產(chǎn)生PPT[50]。中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所與中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心合作,將人參來源的達(dá)瑪烯二醇-Ⅱ合酶(PgDDS)、細(xì)胞色素P450(CYP716A47)等導(dǎo)入酵母細(xì)胞,構(gòu)建了可以合成PPD的酵母細(xì)胞[51]。后對(duì)其合成代謝路徑中最先影響人參皂苷前體合成的關(guān)鍵酶HMGR進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，構(gòu)建高效的生物合成途徑,結(jié)合雙相發(fā)酵工藝優(yōu)化,最終將PPD的產(chǎn)量提高至1 g/L水平[52]。近期，進(jìn)一步通過基因模塊組合優(yōu)化的方法，已將細(xì)胞工廠合成人參三萜類產(chǎn)物的通量提高至10 g/L,并創(chuàng)建出人參皂苷前體產(chǎn)量可達(dá) 15 g/L的高效酵母細(xì)胞工廠[53]。在此研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過引入不同植物來源的β-香樹酯合酶、齊墩果酸合酶和原人參三醇合酶,構(gòu)建了多種類型人參皂苷苷元的代謝合成模塊,實(shí)現(xiàn)了人工設(shè)計(jì)的酵母細(xì)胞可同時(shí)生物合成齊墩果酸(0.021 0 g/L)、原人參二醇(0.017 2 g/L)和原人參三醇(0.015 9 g/L)這3種人參皂苷苷元類人參功效物質(zhì)(圖4)[52]。這些合成生物學(xué)研究的探索都說明了人工設(shè)計(jì)的人參酵母等細(xì)胞工廠生物合成人參皂苷苷元均達(dá)到了相當(dāng)可觀的水平,并可用于人參皂苷苷元等產(chǎn)物的大量生產(chǎn),為最終的多種人參皂苷生物合成奠定了重要基礎(chǔ)。

圖4 人參酵母中3種人參皂苷苷元的合成途徑設(shè)計(jì)[52]

生物合成的人參皂苷苷元最終目的是為了獲取連接由糖基修飾的人參皂苷產(chǎn)物,該步驟由UGTs催化苷元的糖基化反應(yīng)來完成。糖基轉(zhuǎn)移酶催化人參皂苷苷元的糖基化反應(yīng)，合成人參皂苷產(chǎn)物是整個(gè)生物合成途徑中的最后一個(gè)關(guān)鍵步驟,是多樣性人參皂苷產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵。中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所與中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所合作[38,40,54],對(duì)13 個(gè)人參屬植物的cDNA 數(shù)據(jù)庫中相關(guān)合成原件進(jìn)行發(fā)掘,選取長(zhǎng)度大于1 320 bp的帶有PSPG(植物次級(jí)代謝產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶C端的保守序列,用于結(jié)合高能糖供體[55])模序的開放閱讀框,通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)從人參愈傷組織制備的mRNA中成功克隆并表達(dá)了 80 多個(gè)新UGTs,將其導(dǎo)入酵母底盤細(xì)胞進(jìn)行功能表征分析,鑒定了參與稀有人參皂苷 CK、Rh2、Rg3、Rh1和F1合成的5個(gè) UGTs。在此基礎(chǔ)上,分別將稀有人參皂苷 CK、F1、Rh1、Rh2和Rg3 單體的合成途徑引入酵母底盤細(xì)胞(圖5),成功實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖到多種稀有人參皂苷單體的一步制備法(產(chǎn)量分別可達(dá)2.4×10-4、0.042、0.093、0.017和0.049 g/L)。近期,通過酵母底盤細(xì)胞關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)化,Rh2產(chǎn)量已大于2 g/L[56]。Zhuang等[57]通過分析釀酒酵母來源的UGT51結(jié)構(gòu),對(duì)酶與底物進(jìn)行分子對(duì)接和定點(diǎn)突變等進(jìn)行半理性設(shè)計(jì),成功使其催化原人參二醇的效率(kcat/Km)提升了1 800倍,并將UGT51構(gòu)建到酵母底盤細(xì)胞,通過代謝途徑優(yōu)化和分批補(bǔ)料式發(fā)酵可得到約0.30 g/L的Rh2。目前,雖然利用合成生物學(xué)技術(shù)已制備出一些稀有人參皂苷,但如人參皂苷CK、Rh2等的產(chǎn)量仍具有很大的提升空間。因此,對(duì)人參皂苷合成的生物元件糖基轉(zhuǎn)移酶類的挖掘、鑒定與改造,可為定向合成不同人參皂苷單體以及進(jìn)一步獲得高產(chǎn)人參皂苷的人工細(xì)胞工廠提供重要借鑒。

圖5 人參酵母工廠示意[38,40,54]

4 結(jié)論與展望

人參皂苷是植物人參中的重要活性物質(zhì)。人參皂苷產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定、生物活性研究及其生物合成途徑的關(guān)鍵酶探索、代謝合成模塊設(shè)計(jì)優(yōu)化、生物合成策略設(shè)計(jì)調(diào)控和生產(chǎn)方法的改進(jìn)與創(chuàng)新一直是研究熱點(diǎn)。人參皂苷的糖基配體數(shù)目、鍵合位置和類型各不相同,形成了生物活性差異顯著且數(shù)量較多的人參皂苷產(chǎn)物,其中大多數(shù)是達(dá)瑪烷或齊墩果烷型且具有重要藥用價(jià)值的人參皂苷產(chǎn)物。然而,生物活性較高的稀有人參皂苷在天然人參植物中的含量極低,甚至是痕量的,難以大量獲取。迄今為止對(duì)植物組織培養(yǎng)和反應(yīng)器的研究已經(jīng)比較成熟,但在植株中的人參皂苷含量依然較低,定向制備高活性的人參皂苷單體仍然是目前尚需解決的問題。

隨著人們對(duì)人參等植物全基因組序列的生物信息學(xué)分析,對(duì)人參皂苷生物合成途徑的關(guān)鍵基因解析,闡述了人參皂苷的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制,為合成生物學(xué)人工構(gòu)建人參皂苷的生物合成途徑與模塊化設(shè)計(jì)優(yōu)化奠定了重要基礎(chǔ)。研究者利用合成生物學(xué)方法在工程酵母細(xì)胞中構(gòu)建了一些人參皂苷的完整合成途徑,成功實(shí)現(xiàn)了人參酵母細(xì)胞工廠，制備出PPD、PPT和齊墩果酸苷元以及幾種人參皂苷單體,其中部分人參皂苷苷元產(chǎn)物的產(chǎn)量水平能達(dá)10 g/L。目前,定向生物合成稀有人參皂苷CK、Rg3等產(chǎn)物的產(chǎn)量尚不盡如人意,其主要環(huán)節(jié)可能在糖基轉(zhuǎn)移酶這一最后的重要環(huán)節(jié)。此外,與傳統(tǒng)路線相比,現(xiàn)有的人參皂苷生物合成技術(shù)的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)仍不明顯。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,植物基因組的測(cè)序技術(shù)將低成本化,對(duì)于高通量化學(xué)合成基因技術(shù),特征元件的挖掘鑒定、底盤細(xì)胞的性能、發(fā)酵方法的優(yōu)化都將得到進(jìn)一步的完善,最終有望實(shí)現(xiàn)多種稀有人參皂苷的高效人工合成。合成生物學(xué)等生物法策略有望發(fā)展成為提高人參皂苷生產(chǎn)的有效技術(shù)手段,解決稀有人參皂苷類產(chǎn)物直接提取成本高、收益極低等重要問題,從而緩解稀有人參皂苷的市場(chǎng)供需不足,為人參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)幫助。