生根劑處理對于茶樹嫩枝扦插內(nèi)源激素水平和繁殖的影響

任恒澤，張麗霞*，向勤锃，韓曉陽，于謙，蔡魯

1. 山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院，山東 泰安 271018；2. 山東圣豪植物科技有限公司，山東 濱州 256600

茶樹是我國重要的經(jīng)濟作物之一，隨著社會的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)提出了更高的要求。與有性繁殖茶苗相比，無性茶苗具有保持母本原有的優(yōu)良特性，后代性狀一致，繁殖系數(shù)高等優(yōu)點。

目前，扦插是茶樹最主要的無性繁殖方法[1]。在材料選擇上，主要以具有一定木質(zhì)化程度的一芽一葉 3.33 cm長短穗作為扦插材料[2-4]。隨著枝條成熟度的增加，細胞分裂活性下降，生根阻礙物質(zhì)增多[5-6]，導(dǎo)致生根慢，根量??；而且長期采集半木質(zhì)化插穗，容易加快對母樹養(yǎng)分的消耗，削弱樹勢，不利于長期提供健壯插穗。嫩枝插穗在育苗過程中因失水快，管理條件要求高，在茶樹無性系苗生產(chǎn)中應(yīng)用較少，但是隨著現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，全光照彌霧技術(shù)的應(yīng)用可以為茶樹嫩枝扦插苗的生長提供更適宜的環(huán)境，充分發(fā)揮嫩枝扦插生根快，生根量大，成苗快等優(yōu)點。

不定根的形成是茶樹扦插成功的首要條件[7]，外源激素處理和內(nèi)源激素水平對茶樹不定根的誘導(dǎo)和形成有著重要的影響。目前，關(guān)于激素對茶樹扦插苗生長影響的研究主要有兩個方面：一是外源生根劑種類及其濃度和浸泡時間對扦插苗生長的影響[2,8-10]，另一方面主要是茶樹插穗扦插后內(nèi)源激素的動態(tài)變化[11]。但對于外源激素處理對茶苗內(nèi)源激素含量的影響，以及內(nèi)外源激素總體水平對茶樹扦插苗根系和地上部生長的影響缺乏系統(tǒng)的研究。

在全光照微噴彌霧條件下，本研究對茶樹嫩枝進行不同修剪和生根劑浸泡不同時間處理，對嫩枝內(nèi)源激素含量和分布，浸泡生根劑前后生根部位內(nèi)源激素含量變化，以及扦插后插穗根系和地上部生長情況進行研究，探討茶樹嫩枝扦插適宜的生根劑處理時間和內(nèi)源激素水平，為茶樹嫩枝扦插提供實踐和理論上的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

茶樹（Camellia sinensisL.）為臺茶12號（又名金萱），樹齡為3齡，栽種于山東省肥城市山東農(nóng)業(yè)大學茶學系校外試驗基地，于2017年6月12日剪取茶樹一芽六葉嫩枝作為供試材料。

1.2 試驗環(huán)境

塑料大棚內(nèi)建有育苗池，育苗池內(nèi)鋪有15 cm厚珍珠巖作為育苗基質(zhì)。育苗池上方布設(shè)微噴彌霧管道，彌霧直徑為0.01 mm左右，用時間控制器控制噴霧時間和間隔時間。通過通風、噴霧等措施將棚內(nèi)空氣相對濕度控制在90%左右，溫度控制在22～28℃。育苗前期以葉片不萎蔫為原則，通常每隔10 min噴霧5 s左右，早晨、傍晚和陰天減少噴霧時間，增大噴霧時間間隔，晴天中午與之相反。育苗后期，減少水分供應(yīng)，適當煉苗。

1.3 試驗設(shè)計

浸泡生根劑之前剪取茶樹嫩枝頂部一芽一葉至一芽二葉初展梢（BL1）、半功能葉（L2）、第1片功能葉（L3）及其莖段（S1）、第2片功能葉（L4）及其莖段（S2）、第3片功能葉（L5）及其莖段（S3）、第4片功能葉莖段（S4），迅速置于液氮中，然后保存在-80℃條件下，用于內(nèi)源IAA、ZR、ABA和GA3含量測定。插穗修剪處理和編號見圖1（F3-1）。

根據(jù)頂梢芽葉摘除與否及保留功能葉的葉片數(shù)，將茶樹插穗修剪成兩類，第一類保留頂梢（F-1組），保留1～3片功能葉，依次編號為：F1-1、F2-1、F3-1。第二類摘除頂梢（F-2組），保留1～3片功能葉，依次編號為：F1-2、F2-2、F3-2。將修剪好的插穗基部浸泡在100 mg·L-1的ABT-1號生根劑中，浸泡深度為3 cm，每個處理分別浸泡 0、0.5、1、2、4 h，浸泡生根劑后，剪取插穗帶腋芽莖基部2 cm左右材料，立即放入液氮中，然后置于-80℃下保存，用于內(nèi)源IAA、ZR、ABA和GA3含量測定，剪取莖基部后，插穗剩余部分棄掉。隨后將經(jīng)生根劑不同浸泡時間處理的插穗扦插于育苗圃中。扦插時每個處理扦插20棵，重復(fù)3次。60 d后，將茶苗移出育苗圃。將移出育苗圃的茶苗洗凈后，進行根系指標和地上部生長指標測定，每個處理隨機選取長勢一致的茶苗 3株，其平均值作為1次重復(fù)，對3個重復(fù)的平均值進行差異顯著性分析。

圖1 插穗修剪處理及編號Fig. 1 The treatment and number of tea cuttings

1.4 試驗觀察與測定方法

1.4.1 內(nèi)源激素含量測定

取茶樹嫩梢不同部位莖葉和經(jīng)生根劑不同浸泡時間處理的插穗莖基部，液氮研磨成粉末，經(jīng)干冰處理后送至中國農(nóng)業(yè)大學，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）[12]進行IAA、ZR、ABA和GA3含量測定，每個處理重復(fù)3次。

1.4.2 生根指標測定

（1）生根條數(shù)：計數(shù)統(tǒng)計；（2）最長根長：用直尺進行測定；（3）鮮質(zhì)量：將根切下，用電子天平稱量根系鮮質(zhì)量；（4）總根長、根表面積、根體積和根尖數(shù)：取新鮮根，放在盛有水的硬塑料板中，用2007專業(yè)版WinRHIZO根系分析系統(tǒng)對根系進行掃描分析；（5）生根率：直接計數(shù)統(tǒng)計（生根率=生根茶苗數(shù)量/扦插苗總數(shù)×100%）；（6）根系活力：用TTC（氯化三苯基四氮唑）還原法測定根系活力[13]。

1.4.3 地上部生長指標測定

（1）成活率：直接計數(shù)統(tǒng)計（成活率=成活茶苗數(shù)量/扦插苗總數(shù)×100%）；（2）鮮質(zhì)量：將根切除，用電子天平稱量茶苗鮮質(zhì)量；（3）枝梢長度：用直尺進行測定；（4）基部莖粗：用數(shù)顯游標卡尺進行測定；（5）葉片數(shù)：直接計數(shù)統(tǒng)計。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2003整理數(shù)據(jù)，利用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析（Duncan法），采用Origin Pro 8.5進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹嫩枝不同部位莖葉內(nèi)源激素含量

2.1.1 茶樹嫩枝不同部位葉片內(nèi)源激素含量

從圖 2可以看出，茶樹葉片中IAA呈單峰變化趨勢，隨著葉片成熟度增加而增加，以第2片功能葉（L4）含量最高，隨后降低（L5＜L4）；ZR含量上部芽葉（BL1）低于 L2—L5，且L2、L3、L4之間差異不顯著；GA3含量隨葉片成熟度增加呈遞增趨勢，且各部位葉片差異顯著。ABA在BL1、L2和L3中含量基本一致，但顯著低于L4、L5。

2.1.2 茶樹嫩枝不同部位莖段內(nèi)源激素含量

茶樹嫩枝不同莖段內(nèi)源激素含量的變化情況與葉片不同。從圖2可以看出，IAA含量從上部往下呈現(xiàn)階梯式下降，其中S1、S2和S3的IAA含量相近，而S4的含量則顯著降低；ZR含量呈單峰變化趨勢，以S2含量最高，且各莖段之間差異顯著。GA3隨著莖成熟度的增加含量下降。莖中 S1的 ABA含量顯著高于S2、S3和S4，但后三者中的ABA含量無顯著差異。

2.1.3 茶樹嫩枝不同部位葉與對應(yīng)莖段內(nèi)源激素含量比較

由圖 2可以看出，第 1片功能葉（L3）與其對應(yīng)莖段（S1）激素含量相比，其IAA、ZR和GA3含量無顯著差異，而ABA則顯著低于 S1。第 2片功能葉（L4）的 IAA、GA3和 ABA含量顯著高于其對應(yīng)莖段（S2），但ZR含量顯著低于S2。第3片功能葉（L5）中所檢測的 4種激素含量均大于其對應(yīng)莖段（S3），且差異顯著。

2.2 浸泡生根劑后對插穗莖基部內(nèi)源激素的影響

2.2.1 浸泡生根劑后對插穗莖基部內(nèi)源激素含量的影響

由圖3可知，插穗基部浸泡生根劑后，不同內(nèi)源激素含量變化不同。與不定根誘導(dǎo)和形成有關(guān)的 IAA經(jīng)浸泡生根劑處理后其插穗基部含量均明顯增加，浸泡處理4 h的插穗基部IAA含量比浸泡生根劑前提高了2～4倍，但嫩度較高的插穗 F1-1、F1-2、F2-1基部在浸泡前期（1 h以內(nèi)）IAA含量提升幅度較大，后期（1 h以后）則變幅較小，成熟度較高的插穗F2-2、F3-1、F3-2基部IAA含量則隨浸泡生根劑的時間延長呈遞增趨勢，在浸泡生根劑4 h時數(shù)值最大。

圖2 茶樹不同部位莖葉內(nèi)源IAA、ZR、ABA和GA3含量Fig. 2 The contents of endogenous IAA,ZR,ABA,GA3 in different leaves and stems

對不定根發(fā)育有抑制作用的ABA含量在浸泡生根劑前1 h的變化情況與插穗是否摘梢有關(guān)。在浸泡生根劑前 1 h，保留頂梢的插穗F1-1、F2-1基部ABA含量有顯著降低，F(xiàn)3-1的ABA含量緩慢上升；摘梢的插穗F1-2、F3-2在浸泡生根劑前1 h內(nèi)ABA含量明顯升高，F(xiàn)2-2則在浸泡生根劑0.5 h內(nèi)ABA含量快速上升。在浸泡生根劑2～4 h范圍內(nèi)，摘除頂梢插穗F1-2、F2-2莖基部ABA含量開始下降，F(xiàn)3-2在該時間段內(nèi)ABA含量變化不大，到浸泡生根劑 4 h時，F(xiàn)1-2、F2-2、F3-2的 ABA含量與浸泡生根劑前基本一致。

茶樹插穗莖段基部 ZR和 GA3含量均較低，在生根劑浸泡過程中含量有增有減，ZR含量變化范圍為 4～10 ng·g-1，GA3變化范圍在4～8 ng·g-1。保留 3片功能葉插穗 F3-1、F3-2在浸泡生根劑 0～1 h范圍內(nèi)，ZR含量分別上升了 70.12%和 63.70%，在 2～4 h內(nèi)含量略有下降。

2.2.2 浸泡生根劑后對插穗莖基部內(nèi)源激素比值的影響

從圖4可以看出，浸泡生根劑后可以影響插穗莖基部不同激素的比值。插穗保留1片功能葉（F1-1、F1-2）時，浸泡生根劑1 h與4 h的IAA/ZR值相近；保留2片功能葉時，保留頂梢插穗隨（F2-1）浸泡生根劑時間延長IAA/ZR值增加，去梢插穗（F2-2）以浸泡生根劑2 h時IAA/ZR值最大；保留3片功能葉（F3-1、F3-2）時，IAA/ZR隨浸泡生根劑時間的延長不斷增加。功能葉數(shù)越多的插穗，在浸泡生根劑 4 h后 IAA/ZR值及其與浸泡前IAA/ZR的差值越大。帶1片功能葉時，保留頂梢和摘除頂梢插穗 IAA/ZR值分別為 7.44和8.35，增加值分別為4.04和4.95；帶2片功能葉時，保留頂梢和摘除頂梢插穗IAA/ZR值分別為9.67和9.34，增加值分別為5.47和5.14；帶3片功能葉時，保留頂梢和摘除頂梢插穗IAA/ZR值分別為10.72和11.68，增加值分別為5.81和6.27。

IAA/ABA與（IAA+ZR+GA3）/ABA值變化趨勢基本一致。所有插穗IAA/ABA值在浸泡生根劑4 h后由浸泡生根劑前的0.5左右增至1.0左右，（IAA+ZR+GA3）/ABA值由浸泡生根劑前的小于0.8增加到1.0以上。其中，插穗F1-1和F2-1基部在浸泡生根劑1 h以內(nèi)上述兩個比值均增至1.0以上；而其他插穗則需要3～4 h時才能提高至1.0左右。

圖3 生根劑浸泡前后對莖段基部IAA、ZR、GA3和ABA含量的影響Fig. 3 The effects of rooting agent treatment duration on the contents of IAA,ZR,GA3 and ABA

圖4 生根劑浸泡前后對莖段基部激素比值的影響Fig. 4 The effects of rooting agent treatment duration on the phytohormone ratio of basal stems

2.3 生根劑不同浸泡時間處理對茶樹扦插苗根系生長發(fā)育的影響

由表1可知，除摘除頂梢?guī)?片功能葉插穗（F2-1）外，其他插穗的根鮮重、總根長、根表面積、根體積和根尖數(shù)都以浸泡生根劑4 h最大；而插穗的最大生根條數(shù)則隨著功能葉片數(shù)或莖基部成熟度的增加，所需要浸泡生根劑的時間越長，保留1片、2片和3片功能葉的插穗所需浸泡生根劑的時間分別為1 h以內(nèi)、1～2 h和4 h。所有插穗的根系活力在浸泡生根劑2 h以內(nèi)達到最大值。

2.4 不同材料對茶樹扦插苗根系生長發(fā)育的影響

在該育苗條件下，不同材料插穗生根率均為100%，由表1可以看出，保留頂梢和增加功能葉片數(shù)有利于根系的生長發(fā)育。功能葉數(shù)相同時，保留頂梢插穗在根鮮重、生根條數(shù)、根系活力、總根長、根表面積、根體積和根尖數(shù)方面要高于去梢插穗；在保留頂梢和摘除頂梢各自組內(nèi)，隨著插穗保留功能葉片數(shù)的增加，茶苗根鮮重、生根條數(shù)、最長根長、總根長、根表面積、根體積和根尖數(shù)不斷增加。

2.5 生根劑不同時間浸泡處理對茶樹扦插苗地上部生長發(fā)育的影響

從表2和表3可以看出，隨浸泡生根劑時間的延長，移苗時茶苗平均質(zhì)量呈現(xiàn)先降低再升高的波動變化；在浸泡生根劑前1 h內(nèi)，茶苗的平均株高和平均高度增加值（△H）變化不大，但是在浸泡生根劑1～4 h范圍內(nèi)不斷增加，且均以浸泡生根劑4 h達到最大值，分別為15.43 cm和5.53 cm；在浸泡生根劑2 h以內(nèi)，茶苗平均基部莖粗和平均莖粗增加值達到最大值；生根劑不同浸泡時間處理對插穗新增功能葉影響不大。

2.6 不同材料對茶樹扦插苗地上部生長發(fā)育的影響

所有扦插苗成活率均為100%，從表2和表 3可以看出，移苗時保留頂梢插穗的茶苗重量、高度增加值和新增功能葉都大于去梢插穗的，且前者均有2片左右新功能葉，而后者卻無。茶苗平均高度增加值不僅與插穗功能葉數(shù)有關(guān)，而且與頂梢的保留或摘除密切相關(guān)，其中，保留頂梢插穗其值隨功能葉數(shù)增加先降后增，摘除頂梢插穗則不斷下降。莖粗增加值隨插穗功能葉數(shù)增加而增大，此外，當插穗帶1片和3片功能葉時，莖粗增加值表現(xiàn)為帶梢插穗大于去梢插穗，帶2片功能葉時情況相反。

表1 生根劑不同浸泡時間處理對茶樹扦插苗根系生長發(fā)育的影響Table 1 Effects of rooting agent treatment duration on rooting in tea clones

注：大寫字母表示每一項縱列顯著性差異（P＜0.01），小寫字母代表每一項橫行顯著性差異（P＜0.05）。F1-1：保留頂梢?guī)?片功能葉插穗；F1-2：摘除頂梢?guī)?片功能葉插穗；F2-1：保留頂梢?guī)?片功能葉插穗；F2-2：摘除頂梢?guī)?片功能葉插穗；F3-1：保留頂梢?guī)?片功能葉插穗；F3-2：摘除頂梢?guī)?片功能葉插穗。下同。Note: Different uppercase letters in the table indicate highly significant difference in each column at the P＜0.01 level anddifferent lowercase letters indicate significant difference in each row at the P＜0.05level. F1-1: Cuttings with one functional leaf andapical shoot. F1-2: Cuttings with one functional leaf andexcised apical shoot. F2-1: Cuttings with twofunctional leaves andapical shoot.F2-2: Cuttings with twofunctional leaves andexcised apical shoot. F3-1: Cuttings with three functional leaves andapical shoot. F3-2: Cuttings with three functional leaves andexcised apical shoot.The same below.

表2 扦插前插穗形態(tài)指標Table 2The morphological indexes of tea cuttings before cuttage

3 討論

3.1 內(nèi)外源激素水平對茶樹扦插苗生長的影響

在保留4片功能葉的綠色嫩枝中，茶樹插穗第 1至 3片功能葉對應(yīng)莖段（S1—S3）中IAA含量相對穩(wěn)定，第2至4片功能葉對應(yīng)莖段（S2—S4）中ABA含量相近。插穗莖基部激素含量及扦插苗的生長受生根劑浸泡時間、頂梢保留或摘除以及功能葉數(shù)的影響。

生長素由幼嫩莖葉合成，通過極性運輸被運到插穗基部，促進生根[14-15]。浸泡100 mg·L-1ABT-1號生根劑有利于提高插穗莖基部 IAA含量，并使 IAA/ZR、IAA/ABA和(IAA+ZR+GA3) /ABA值增加，有利于扦插苗根系和地上部的生長。另外，保留頂梢的插穗在扦插苗生長過程中，能持續(xù)為茶苗供應(yīng)IAA，使插穗莖基部 IAA維持在一定水平，更有利于根系的生長。

3.2 生根劑浸泡時間對插穗莖基部激素含量和比值的影響

浸泡生根劑可以改變插穗莖基部內(nèi)源激素的含量和比值。保留頂梢?guī)?片和2片功能葉插穗（F1-1、F2-1）在浸泡生根劑前期 1 h內(nèi) IAA含量快速增加，在 1～4 h范圍內(nèi) IAA含量相對穩(wěn)定；其他插穗（F1-2、F2-2、F3-1、F3-2）則在浸泡生根劑4 h后達到最大值。成熟度高的嫩枝 IAA含量在浸泡生根劑過程中增加較快，可能因為輸導(dǎo)組織發(fā)育更為健全，有利于外源生根劑進入插穗并促進內(nèi)源 IAA的合成。在浸泡生根劑前期，可能因為保留頂梢的插穗葉面積大，蒸騰拉力大，摘除頂梢由于傷口愈合等原因，降低了蒸騰拉力，使得保留頂梢插穗IAA含量上升較摘除頂梢插穗快。

機械損傷和干旱脅迫可以提高植物內(nèi)源ABA水平[16]，ABA對不定根的形成有抑制作用[17]。由于機械損傷和干旱脅迫，使摘除頂梢插穗的ABA含量在浸泡生根劑前期明顯上升，浸泡生根劑后期，由于復(fù)水及生根劑的作用，使得插穗內(nèi)ABA含量趨于穩(wěn)定甚至開始降低。ABA含量的減緩增長或降低有利于不定根的發(fā)生。

細胞分裂素對生長素有拮抗作用，含量過高抑制不定根的形成[18]。另一方面，細胞分裂素參與維管發(fā)育的調(diào)節(jié)，可以促進莖的增粗[19]。而且 IAA/ZR值高有利于根的生長，IAA/ZR值低有利于莖的生長。在浸泡生根劑過程中，ZR含量變化不大，但IAA/ZR值不斷增加。因此，浸泡生根劑時間短，IAA/ZR值低，有利于莖的增粗；浸泡生根劑時間長，IAA/ZR值高，有利于根系的發(fā)育。

保留頂梢?guī)?片和2片功能葉插穗（F1-1、F2-1）浸泡生根劑 0.5～1 h后 IAA/ABA 和(IAA+ZR+GA3)/ABA值可增至 1.0以上，其他插穗（F1-2、F2-2、F3-1、F3-2）則在浸泡生根劑 4 h后上述兩個指標達到最大值。IAA、ZR和GA3屬于生長刺激型激素，ABA屬于生長抑制型激素[20]。IAA/ABA 和(IAA+ZR+ GA3)/ABA值增加有利于生根，前人研究也發(fā)現(xiàn)，IAA/ABA值與插穗的生根能力成正相關(guān)[6,11]。

3.3 茶樹嫩枝扦插適用材料

保留頂梢和一定數(shù)量的功能葉有利于茶樹扦插苗根系和地上部的生長[21]。適宜茶樹嫩枝扦插苗根系和地上部生長的材料為保留頂梢?guī)?片功能葉插穗。摘除頂梢處理的扦插苗根系和地上部生長雖然不如保留頂梢的，但是對于半生產(chǎn)和半提供插穗的茶園而言，進行春季扦插，摘除頂梢一方面可以協(xié)調(diào)茶葉生產(chǎn)與苗木生長之間的矛盾，另一方面打頂可以解除頂端優(yōu)勢，促進莖的增粗和莖中營養(yǎng)物質(zhì)的積累。

另外，對于茶樹不同品種，木質(zhì)化程度高的插穗內(nèi)外源激素水平對茶苗根系和地上部生長的影響，以及外源激素通過哪些信號途徑影響到內(nèi)源激素水平從而影響生根還需進一步研究。