(+)-兒茶素緩解大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓的作用和機(jī)制

顏俊杰，陳方政，陳羅薇，王恒，黃靜雯，金陸飛，徐于惠，袁琳波

1. 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325000；2. 溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，浙江 溫州 325000；3. 溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院，浙江 溫州 325000；4. 溫州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室 浙江 溫州 325000

肺動(dòng)脈高壓（Pulmonary artery hypertension,PAH）是以肺動(dòng)脈壓力持續(xù)升高為特征的臨床綜合征，最終可導(dǎo)致右心衰竭以及死亡[1]。國內(nèi)外學(xué)者對于肺動(dòng)脈高壓的研究都集中于低氧、炎性等動(dòng)物模型，側(cè)重分析各種因子變化、血管再生和重塑、動(dòng)脈狹窄、低氧誘導(dǎo)、細(xì)胞增殖等方面[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，eNOS和NO的含量在血液中均下降[3]，而感受細(xì)胞外 Ca2+離子水平的鈣感受器（CaSR）可能在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起調(diào)控作用[4]。

(+)-兒茶素（2R,3S-catechins，(+)-C）可改善高血壓患者血管內(nèi)皮功能，改善動(dòng)脈冠狀動(dòng)脈疾病患者的血流介導(dǎo)擴(kuò)張[5-7]，但是目前尚無與(+)-C在PAH中應(yīng)用相關(guān)的研究。本文研究了(+)-C對PAH的治療作用，以及其治療機(jī)制與NO對肺動(dòng)脈內(nèi)皮的保護(hù)作用和CaSR抑制血管重構(gòu)作用的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)，所有動(dòng)物試驗(yàn)按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)方針》下執(zhí)行。選用雄性SD大鼠，體重180～200 g（申請?zhí)枺?0140038），由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在試驗(yàn)開始之前，試驗(yàn)動(dòng)物在新的環(huán)境下（12 h光照/12 h黑暗周期循環(huán)，溫度為(22±2)℃，50%相對濕度和標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力）生活1周來適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。

1.2 主要試劑

(+)-C（批號：154-23-4；多酚含量＞98%）購自中國上海源葉公司，并用 DMSO稀釋至10 mg·L-1，試驗(yàn)表明，當(dāng) DMSO體積分?jǐn)?shù)小于0.2%時(shí)，對試驗(yàn)結(jié)果無影響[8]。Anti-CaSR抗體購自Abcam，eNOS抗體購自BD公司，β-actin抗體購自 Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）。羊抗鼠免疫球蛋白G和羊抗兔免疫球蛋白購自Santa Cruz公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PH模型的建立

使用自制簡易的常壓低氧裝置實(shí)現(xiàn)低氧條件，在艙內(nèi)放測氧儀及鈉石灰、無水氯化鈣以吸收艙內(nèi) CO2和 H2O，調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁靠刂婆搩?nèi)氧氣濃度為10%。4周后測定各組大鼠右心室收縮壓、右心室增厚指數(shù)及肺血管重塑指標(biāo)已確定PH模型的建立[9]。

將大鼠隨機(jī)分為 3組：（1）對照組（n=9），不進(jìn)行任何處理，其他培養(yǎng)條件同各處理組；（2）缺氧模型組（n=9），暴露于低氧條件（10%O2）連續(xù)4周（每天 8 h），設(shè)立缺氧PH模型；（3）(+)-C干預(yù)組（n＝9），腹腔注射兒茶素（20 mg·kg-1，一天兩次）[10]。腹腔注射后，將其暴露于低氧條件下（10% O2）連續(xù)4周（每天8 h），設(shè)立(+)-C治療后的缺氧PH模型。每周給各組大鼠稱重1次。

1.3.2 肺動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)測量

對大鼠右側(cè)頸外靜脈和頸總動(dòng)脈進(jìn)行插管，調(diào)整插管位置，直到通過多參數(shù)監(jiān)測儀PM-8000顯示典型的曲線。插管深度做細(xì)微調(diào)整，以便準(zhǔn)確反映肺動(dòng)脈壓力的一個(gè)點(diǎn)。對肺動(dòng)脈壓力數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄并計(jì)算 mPAP。使用CO pod（ml313c，AD Instruments）和PowerLab/4sp數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)同時(shí)測量心輸出量（CO）。最后通過公式（PVR=mPAP/CO）計(jì)算出PVR。

1.3.3 右心室肥厚指數(shù)測量

右心室肥厚指數(shù)（RVHI）反映右心室的肥厚程度。分離出被處死的大鼠心臟，從腹側(cè)解剖心房和主要血管。將右心室（RV）從附有室間隔（S）的左心室（LV）中分離出來。最后將[RV/(LV+S)]質(zhì)量比值作為RVHI。

1.3.4 肺動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)觀察

肺組織用體積百分?jǐn)?shù)為 10%的甲醛室溫下固定 24 h后，石蠟包埋并沿縱軸切片，切片厚度為3.5 μm，并進(jìn)行HE染色，觀察大鼠肺小動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)變化。選取200 μm以下的肺微小血管，每組選取30個(gè)血管橫切面視野，采用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件 IPP測定肺血管重構(gòu)指數(shù)。WT%按公式[(外周血管直徑－肺動(dòng)脈血管內(nèi)徑)/外周血管直徑×100%]計(jì)算。

1.3.5 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率的測定

采用 CCK-8法測定肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率。將對照組，缺氧模型組和（+）-兒茶素干預(yù)組的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；移取肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔 2 000個(gè)，采用 CCK-8試劑盒測定存活率，于450 nm波長下檢測吸光度值。

1.3.6 肺動(dòng)脈細(xì)胞內(nèi)蛋白的檢測

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法分別測定肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中 eNOS表達(dá)量及平滑肌細(xì)胞CaSR。將組織細(xì)胞總蛋白溶解并分離在1×緩沖液（Bio-Rad）中，提取各組細(xì)胞總蛋白，并用 BCA試劑盒進(jìn)行濃度定量檢測。使用10%的丙烯酰胺凝膠裝載蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至 ED Immobilon-P膜（微孔，Bedford，MA）上，分別檢測免疫anti-CaSR抗體和抗eNOS抗體。

1.3.7 肺動(dòng)脈細(xì)胞內(nèi)總Ca2+濃度的檢測

采用熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)總Ca2+濃度。使用HEPES緩沖溶液中的離子組成測定Ca2+。將血管平滑肌細(xì)胞（SMCs）置于 137 mmol·L-1NaCl，5.9 mmol·L-1KCl，2.2 mmol·L-1CaCl2，1.2 mmol·L-1MgCl2，14 mmol·L-1葡萄糖，10 mmol·L-1蛋白質(zhì)的混合液中，用 pH=10的氫氧化鈉溶液調(diào)整 pH到 7.4。待細(xì)胞生長至 3代，將 50%～60% SMCs 匯合在載 4 μmol·L-1Fura-2乙酰氧基甲基酯（Fura-2/AM；Invitrogen、分子探針、Eugene）的圓形蓋玻片（直徑為25 mm）中，室溫下反應(yīng)60 min，用 HEPES緩沖溶液來沖洗殘留的 Fura-2/AM 30 min。將SMCs放置在一個(gè)記錄槽中，置于倒置熒光顯微鏡（Eclipse ti-E；尼康，日本東京）下，用340 nm和380 nm熒光強(qiáng)度激發(fā)細(xì)胞，在520 nm處發(fā)射的熒光強(qiáng)度即為Ca2+濃度相對值。

1.3.8 肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NO含量的測量

采用NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）定量測定肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液中的NO含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）。兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的St檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用ANOVA，統(tǒng)計(jì)分析采用 SPSS 13.0軟件，雙側(cè)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果分析

2.1 (+)-C影響低氧性大鼠肺血流動(dòng)力學(xué)

由圖1-A可知，對照組的mPAP為(14.844±2.138) mmHg（1 mmHg=0.133 kPa，n=9），缺氧模型組的mPAP為 (39.824±8.563) mmHg（n=9），(+)-C干預(yù)組的mPAP為 (27.751±4.320) mmHg（n=9）。(+)-C干預(yù)組與缺氧模型組相比達(dá)顯著水平（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，(+)-C可明顯降低缺氧誘導(dǎo)的平均肺動(dòng)脈壓mPAP的升高。

由圖1-B可知，對照組的PVR為 (182.259±34.813) mmHg·L-1·min-1（n=9）；缺氧模型組的PVR為(530.682±39.693)mmHg·L-1·min-1（n=9）；(+)-C干預(yù)組的PVR為 (357.035±59.314) mmHg·L-1·min-1（n=9）。(+)-C 干預(yù)下相比缺氧組PVR明顯下降（P＜0.05），可見(+)-C可逆轉(zhuǎn)缺氧引起的肺血管阻力PVR升高。

由圖1-C可知，對照組的RVHI為0.169±0.025（n=9），缺氧模型組的RVHI為0.264±0.031（n=9），(+)-C干預(yù)組的 RVHI為 0.211±0.020（n=9），表明(+)-C可減輕缺氧誘導(dǎo)的右心室肥厚指數(shù)RVHI的增加。

圖1 (+)-兒茶素影響低氧性大鼠肺血流動(dòng)力學(xué)Fig. 1 Effects of (+)-catechins on pulmonary hemodynamics in hypoxic rats

2.2 (+)-C緩解低氧性大鼠肺血管重構(gòu)評價(jià)

由圖 2-B可知，對照組 WT%為 0.058±0.011（n=30），缺氧模型組 WT%為 0.077±0.023（n=30），(+)-C干預(yù)組 WT%為 0.067±0.013（n=30）。經(jīng) HE染色結(jié)果顯示，缺氧模型組肺血管壁明顯比對照組增厚，(+)-C干預(yù)組比缺氧模型組在肺小動(dòng)脈平滑肌層肺血管壁厚度與外周長比 WT%卻有所降低（P＜0.05）（圖2-A），結(jié)果表明(+)-C可抑制肺小動(dòng)脈平滑肌層的血管壁增厚。

2.3 (+)-C影響低氧性大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

由試驗(yàn)可知，對照組的eNOS蛋白表達(dá)量為1.000±0.000（n=3），缺氧模型組的eNOS蛋白表達(dá)為0.240±0.071（n=3），(+)-C干預(yù)組的 eNOS蛋白表達(dá)為 0.409±0.106（n=3）（圖3-B）。蛋白質(zhì)印跡法顯示，缺氧模型組相對于正常對照組 eNOS蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05，圖3-A）。由此可知(+)-C能干預(yù)抑制eNOS蛋白表達(dá)減少，增加其表達(dá)。

由圖 3-C可知，對照組的 NO濃度為(55.777±9.832) μmol·L-1（n=27），缺氧模型組的NO濃度為(27.287±4.343)μmol·L-1（n=27），(+)-C干預(yù)組的NO濃度為(38.961±2.604) μmol·L-1（n=27）。在 NO 濃度上，缺氧模型組較正常對照組有所下降（P＜0.05），（+）-兒茶素干預(yù)下可抑制NO濃度的下降。

2.4 (+)-C影響低氧性大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣及增殖

由圖4-A可知，對照組OD值為0.323±0.056（n=9），缺氧模型組 OD值為 0.726±0.077（n=9），(+)-C干預(yù)組OD值為0.515±0.045（n=9）。對照組OD值參照下，缺氧使大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞明顯增殖（P＜0.05）。通過CCK-8法檢測細(xì)胞活力（OD值），發(fā)現(xiàn)(+)-C可顯著抑制這一效應(yīng)。

圖2 (+)-兒茶素緩解低氧性大鼠肺血管重構(gòu)評價(jià)Fig. 2 Evaluation of (+)-C on pulmonary vascular remodeling in hypoxic rats

圖3 （+）-兒茶素影響低氧性大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Fig. 3 Effects of (+)-C on hypoxic pulmonary artery endothelial cells in rats

由圖4-B和4-C可知，對照組CaSR蛋白表達(dá)量為1.000±0.000（n=3），缺氧模型 CaSR蛋白表達(dá)量為3.100±0.314（n=3），(+)-C干預(yù)組CaSR蛋白表達(dá)量為1.751±0.240（n=3）。分別從細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法，檢測結(jié)果顯示缺氧均升高 CaSR表達(dá)，(+)-C干預(yù)相比缺氧組可下調(diào) CaSR蛋白表達(dá)（P＜0.05）。

由圖4-D可知，對照組Ca2+濃度為2.101±0.678（n＝27），缺氧模型組 Ca2+濃度為45.236±8.331（n＝27），(+)-C 干預(yù)組 Ca2+濃度為26.135±4.965（n＝27）。通過對Ca2+濃度的測定，缺氧模型組相對正常對照組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度大幅增加（P＜0.05）。(+)-C能干預(yù)抑制升鈣效應(yīng)，使得Ca2+濃度有所下降。

圖4 (+)-兒茶素影響低氧性大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣及增殖Fig. 4 Effects of (+)-C on intracellular calcium and proliferation of PAMSCs in hypoxic rats

3 討論

3.1 (+)-C保護(hù)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

(+)-C具有抗氧化、抗高血壓、抗炎、抗增殖、抗血栓等一系列藥理作用[11]，在血管保護(hù)方面存在多種機(jī)制。我們在動(dòng)物模型上觀察到了(+)-C具有減緩因肺缺氧而誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺動(dòng)脈高壓的治療作用，并在分子層面探討了(+)-C對肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)CaSR的影響。

在試驗(yàn)中，我們觀察到(+)-C能使一氧化氮（NO）的濃度上調(diào)。NO具有保護(hù)血管內(nèi)皮、擴(kuò)張肺血管，防止血小板的粘附聚集和抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。NO可阻止白細(xì)胞粘附內(nèi)皮細(xì)胞，幫助白細(xì)胞在內(nèi)皮分子表面的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎抗壓的作用。我們還觀察到在(+)-C的誘導(dǎo)下，eNOS在內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)，這可能是NO合成增加的主要原因。eNOS的增加可以作為(+)-C對內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)作用標(biāo)志。在內(nèi)皮細(xì)胞中，eNOS產(chǎn)生足夠的NO，血管阻力就會(huì)降低，局部炎癥就會(huì)被抑制[12]。

在動(dòng)物試驗(yàn)中，(+)-C減少了低氧誘導(dǎo)的mPAP和 PVR的增加，這表明它可以在體內(nèi)減緩肺動(dòng)脈高壓。隨著肺動(dòng)脈血壓和血管阻力的降低，右心室的壓力負(fù)荷降低，右心室的病理重建被抑制，而RVHI也隨著(+)-C的調(diào)控而減少。根據(jù)WT%和CCK-8檢測結(jié)果顯示，(+)-C使平滑肌細(xì)胞增殖被抑制，中膜遷移，肺動(dòng)脈壁厚降低。

此外，越來越多的證據(jù)表明血管的病變會(huì)產(chǎn)生過剩的活性氧（ROS），并伴隨著抗氧化防御系統(tǒng)的減弱。(+)-C使得ROS直接與NO反應(yīng)，消除其生物活性，改善內(nèi)皮功能來中和活性氧[13]。可見，(+)-C能有效幫助清除ROS，增加 NO的生物利用度，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)eNOS合成NO的活性，完成短時(shí)內(nèi)的血管內(nèi)皮依賴性舒張，達(dá)到降壓作用。

3.2 (+)-C抑制肺動(dòng)脈血管重構(gòu)

我們觀察到在PASMCs中，CaSR的表達(dá)減少，Ca2+濃度降低。CaSR的主要生理功能是檢測細(xì)胞外Ca2+濃度的變化，調(diào)節(jié)甲狀旁腺激素的釋放。作為G蛋白偶聯(lián)受體的C類成員，CaSR在維持細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，CaSR的較高表達(dá)表明它參與了PAH的病理調(diào)控[14]。而(+)-C正是通過抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)CaSR表達(dá)來抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。也有數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，CaSR參與了低氧誘導(dǎo)的 Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[15]。

在肺動(dòng)脈高壓中，PASMCs的CaSR參與增殖和疾病的發(fā)生，它不僅參與血管收縮，還參與血管重構(gòu)[16]。之前報(bào)道過CaSR拮抗劑可以抑制 PAH[17]的血管重構(gòu)。Ca2+濃度的增加是肺血管收縮和PASMC遷移、增殖的主要誘因，繼而引起肺血管重構(gòu)和 PVR增加，最終發(fā)展為肺血管重塑。而(+)-C可以通過降低CaSR表達(dá)水平，顯著抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致的Ca2+濃度[12]。我們通過PH試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?cè)面證實(shí)了(+)-C能誘導(dǎo)CaSR，明顯下調(diào)CaSR的 mRNA蛋白表達(dá)，以降低 CaSR表達(dá)水平來減少細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度，形成血管重構(gòu)，抑制PASMCs增殖。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)通過抑制肺血管收縮和血管重構(gòu)，(+)-C能減緩缺氧引起的肺動(dòng)脈高壓。一方面，(+)-C緩解缺氧引起的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS合成減少和NO減少，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS表達(dá)，上調(diào)NO，這對內(nèi)皮產(chǎn)生保護(hù)作用，抑制肺動(dòng)脈收縮來完成短效的血管張力升高。另一方面(+)-C在PASMCs中抑制CaSR表達(dá)，降低細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度，減緩平滑肌細(xì)胞增殖以實(shí)現(xiàn)血管張力的長效升高并抑制血管重構(gòu)。因此，(+)-C可能是一種新的PAH治療方法。