農(nóng)桿菌介導(dǎo)幾種不同馬鈴薯外植體轉(zhuǎn)化研究

曹貞菊， 李 飛， 陳明俊， 羅小波， 李 標(biāo)， 尹 旺

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴州省馬鈴薯工程中心， 貴陽 550006)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)起源于南美洲，茄科茄屬草本植物，是繼水稻、小麥和玉米后的第四大糧食作物。中國馬鈴薯種植面積占世界總種植面積的30%，種植分布區(qū)涵蓋寒帶、溫帶、亞熱帶、熱帶等多種生態(tài)區(qū)，發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)對保障中國糧食安全、西部扶貧開發(fā)、種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增收具有重要意義[1]。然而馬鈴薯易受非生物脅迫的影響，包含高溫、冷凍、鹽分、干旱、水澇、輻射及重金屬毒性等，這在很大程度上阻礙了馬鈴薯生長且造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2]。其中，冷凍脅迫是影響馬鈴薯產(chǎn)量的主要因素之一。當(dāng)溫度低于-3 ℃時，馬鈴薯很難存活[3]。2008年，中國南部的冰雹導(dǎo)致馬鈴薯直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)15億元[4]。而近年來氣候變化加劇，極端天氣愈加頻繁，挖掘植物自身的耐凍基因，培育耐低溫霜凍的馬鈴薯品種尤顯必要[5]。

脂肪酸脫氫酶基因(FAD2)是植物體內(nèi)脂肪酸代謝中油酸轉(zhuǎn)變?yōu)閬営退岬年P(guān)鍵基因。植物的耐霜凍性依賴于體內(nèi)飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例，飽和脂肪酸在脂肪酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)變單鍵為雙鍵合成不飽和脂肪酸，并且單個脂肪酸的不飽和程度通常受基因和環(huán)境的調(diào)控[6]。

用農(nóng)桿菌介導(dǎo)幾種不同馬鈴薯外植體將具有耐凍性的FAD2基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，并比較不同馬鈴薯外植體轉(zhuǎn)化效率，獲得較為便捷、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化方法，為馬鈴薯基因轉(zhuǎn)化研究提供可行方案。期望獲得綜合抗逆性明顯增強(qiáng)的優(yōu)良馬鈴薯新品系，為馬鈴薯抗性育種提供新材料，創(chuàng)造新種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與菌株

供試馬鈴薯品種中薯8號微型薯和中薯8號組培苗來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所；黃金薯微型薯和Desiree組培苗由貴州省馬鈴薯工程中心實驗室保存；FAD2基因由貴州省馬鈴薯工程中心實驗室克??；根癌農(nóng)桿菌為GV 3101(購自上海維地生物技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1農(nóng)桿菌活化

-80 ℃低溫保存的GV 3101農(nóng)桿菌株含有FAD2基因，接種到含有Kan(50 μg·mL-1)和Rif(20 μg·mL-1)的YEB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于5 mL含有Kan(50 μg·mL-1)和Rif(20 μg·mL-1)的液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，再吸取2 mL菌液接種到50 mL含有Kan(50 μg·mL-1)和Rif(20 μg·mL-1)的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～4 h，觀察菌落生長情況并測OD600值，待OD600值到0.4時進(jìn)行馬鈴薯外植體侵染。

1.2.2遺傳轉(zhuǎn)化

1) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)微型薯遺傳轉(zhuǎn)化

將中薯8號微型薯、黃金薯微型薯分別用蒸餾水沖洗干凈，并用1%的次氯酸鈉浸泡過夜，去皮切成1～2 mm的薄片，放入準(zhǔn)備好的含F(xiàn)AD2基因的GV 3101菌液中浸泡10 min。用無菌鑷子夾出，再無菌濾紙吸干表面多余菌液，轉(zhuǎn)入含有4 mg·L-1ZT和0.2 mg·L-1IAA的MS共培養(yǎng)基上。28 ℃下黑暗培養(yǎng)2 d，見薯塊周圍出現(xiàn)淡淡一圈菌斑即可。

用無菌蒸餾水清洗共培養(yǎng)后的薯塊3次，再用含有250 mg·L-1TIM的無菌蒸餾水浸泡薯塊15 min，置于經(jīng)高溫滅菌的濾紙上，待薯塊表面干后，轉(zhuǎn)至含有4 mg·L-1ZT+0.2 mg·L-1IAA+250 mg·L-1TIM的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)7 d，在培養(yǎng)皿上蓋上6層紗布，每天去除一層紗布，光照強(qiáng)度由弱到強(qiáng)，培養(yǎng)條件為24 ℃、1 500 lx、光照16 h/暗8 h的光周期下培養(yǎng)。將薯塊轉(zhuǎn)至含有4 mg·L-1ZT+0.2 mg·L-1IAA+250 mg·L-1TIM+50 mg·L-1Kan的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選培養(yǎng)，待分化出再生植株長到2～3 cm時，從愈傷組織上切下再生苗插入含有1 mg·L-1IBA+150 mg·L-1TIM的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

2) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯組培苗莖段遺傳轉(zhuǎn)化

將用于轉(zhuǎn)化所需的中薯8號無菌苗和Desiree無菌苗(培養(yǎng)4～5周)，在超凈工作臺內(nèi)，每個莖段切成1～1.5 cm長，需確保莖段上不含有生長點，在馬鈴薯預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，再在農(nóng)桿菌GV 3101中浸泡莖段10 min，用吸水紙吸干后均勻排布在馬鈴薯共培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)3 d，然后將莖段轉(zhuǎn)至馬鈴薯愈傷培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待2～3周后愈傷組織完全長出，將材料轉(zhuǎn)接到馬鈴薯分化培養(yǎng)基上直至長出嫩芽，將1～2 cm嫩芽切下插入馬鈴薯生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)完成完整的抗性組織。

馬鈴薯預(yù)培養(yǎng)基：MS固體培養(yǎng)基+2，4-D(0.1 mg·L-1)+6-BA(1 mg·L-1)

馬鈴薯共培養(yǎng)基：MS固體培養(yǎng)基+2，4-D(0.1 mg·L-1)+6-BA(1 mg·L-1)+AS(0.1 μmol·L-1)

馬鈴薯愈傷培養(yǎng)基：MS固體培養(yǎng)基+2，4-D(0.1 mg·L-1)+6-BA(1 mg·L-1) +TIM(100 mg·L-1)+Kan(50 mg·L-1)

馬鈴薯分化培養(yǎng)基：MS固體培養(yǎng)基+GA3(1 mg·L-1)+ZT(1 mg·L-1) +TIM(100 mg·L-1)+Kan(50 mg·L-1)

馬鈴薯生根培養(yǎng)基：1/2 MS固體培養(yǎng)基+IBA(1 mg·L-1)+TIM(150 mg·L-1)

1.2.3轉(zhuǎn)化株P(guān)CR檢測

參照BioMIG試劑盒操作說明提取馬鈴薯總DNA，以轉(zhuǎn)化株的總DNA為模板，未轉(zhuǎn)化株的總DNA為對照，正向引物為35 S-F 序列為5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，反向引物為FAD2-SmaⅠ-R序列為5′-TCAAGCGTAGTCTGGCATTACTTTTTTAAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為1 300 bp。通過PCR溫度梯度試驗，最佳退火溫度為50 ℃。PCR反應(yīng)體系包括10 μL 2×M 5-Tag -Mix，1 μL的35 S-F正向引物，1 μL的FAD2-SmaⅠ-R反向引物，1 μL DNA模板，用ddH2O補(bǔ)20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果分析

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)微型薯遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果分析

經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染后的中薯8號微型薯薯片、黃金薯微型薯薯片在MS共培養(yǎng)基上28 ℃條件下黑暗培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)至含有4 mg·L-1ZT+0.2 mg·L-1IAA+250 mg·L-1TIM的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)7 d。將薯塊轉(zhuǎn)至含有Kan抗生素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選培養(yǎng)，并逐漸分化出很多小突起。約35 d后，外植體開始萌生小芽點(圖1)。待分化出的再生植株長到 2～3 cm時，從愈傷組織上切下再生苗插入含有Kan的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。經(jīng)過Kan連續(xù)篩選，獲得中薯8號微型薯轉(zhuǎn)化抗性植株15株，黃金薯微型薯轉(zhuǎn)化抗性植株12株。

注：A為黃金薯轉(zhuǎn)化15 d；B為黃金薯轉(zhuǎn)化35 d；C為黃金薯轉(zhuǎn)化55 d；D為黃金薯轉(zhuǎn)化85 d；E為中薯8號轉(zhuǎn)化15 d；F為中薯8號轉(zhuǎn)化35 d；G為中薯8號轉(zhuǎn)化55 d；H為中薯8號轉(zhuǎn)化85 d。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯組培苗莖段遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果分析

經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的中薯8號無菌苗莖段和Desiree無菌苗莖段，在MS共培養(yǎng)基上28 ℃條件下黑暗培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)至愈傷培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待愈傷組織完全長出，再轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上直至長出嫩芽(圖2)，待分化出的再生植株長到 2～3 cm時, 從愈傷組織上切下再生苗插入含有Kan的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。經(jīng)過Kan連續(xù)篩選，獲得中薯8號莖段轉(zhuǎn)化抗性植株13株，Desiree莖段轉(zhuǎn)化抗性植株8株。

2.3 PCR檢測結(jié)果分析

中薯8號微型薯和黃金薯微型薯，中薯8號無菌苗莖段和Desiree無菌苗莖段所獲得的抗性植株進(jìn)行PCR鑒定，中薯8號微型薯和黃金薯微型薯所獲得的抗性植株分別檢測出2株和3株陽性植株，中薯8號無菌苗莖段和Desiree無菌苗莖段所獲得的抗性植株分別檢測出2株陽性植株，均擴(kuò)增出約1 300 bp與陽性對照相對應(yīng)的條帶，而未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株未能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。

2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)不同馬鈴薯外植體轉(zhuǎn)化效率分析

在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，馬鈴薯誘導(dǎo)愈傷分化產(chǎn)生抗性芽，經(jīng)過生根選擇即為抗性植株，試驗分別接種中薯8號微型薯和黃金薯微型薯，中薯8號無菌苗莖段和Desiree各無菌苗莖段各30個，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性芽分別為中薯8號微型薯抗性植株15株，經(jīng)PCR檢測陽性植株有2株，轉(zhuǎn)化率為13.3%；黃金薯微型薯抗性植株12株，經(jīng)PCR檢測陽性植株有3株，轉(zhuǎn)化率為25%。中薯8莖段抗性株13株，經(jīng)PCR檢測陽性株有2株，轉(zhuǎn)化率為15.4%；Desiree莖段抗性株8株，經(jīng)PCR檢測陽性株有2株，轉(zhuǎn)化率為25%。

在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，用中薯8號微型薯、黃金薯微型薯轉(zhuǎn)化，污染較為嚴(yán)重，且需要頻繁的更換培養(yǎng)基，而用無菌的中薯8號和Desiree莖段，污染較微型薯少。并且不同的桿菌濃度，也對試驗過程產(chǎn)生影響，最適農(nóng)桿菌濃度OD600值為0.4，大于或小于0.4均會導(dǎo)致外植體農(nóng)桿菌污染嚴(yán)重而死亡；另外，在抗性植株生根培養(yǎng)過程中使用IBA的生根效果較IAA好。

注：A為Desiree莖段轉(zhuǎn)化15 d；B為Desiree莖段轉(zhuǎn)化35 d；C為Desiree莖段轉(zhuǎn)化75 d；D為中薯8號莖段轉(zhuǎn)化15 d；E為中薯8號莖段轉(zhuǎn)化35 d；F為中薯8號莖段轉(zhuǎn)化75 d。

注：M為marker；P為陽性對照；C為陰性對照，其中A圖中1～3為黃金薯微型薯轉(zhuǎn)化陽性植株；圖B中1～2為Desiree莖段轉(zhuǎn)化陽性植株；圖C中1～2為中薯8號微型薯轉(zhuǎn)化陽性植株；3和4為中薯8號莖段轉(zhuǎn)化陽性植株。

表1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)不同馬鈴薯外植體轉(zhuǎn)化效率分析

3 討 論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最早、最實用、有效且有最多成功實例報道的植物轉(zhuǎn)基因方法，在眾多的轉(zhuǎn)基因植物中80%是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的[7]。馬鈴薯微型薯和莖段是農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化的理想受體，馬鈴薯高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系具有基因型的依賴性，需根據(jù)不同品種、不同基因型和外植體轉(zhuǎn)化關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化選擇。有許多關(guān)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究報道，如齊恩芳等[8]以隴薯11號試管薯為材料，成功將PVX、PVS、PVY和PLRV四種病毒CP融合基因?qū)腭R鈴薯；崔少彬[9]以脫毒微型薯為外植體，成功將ODREB2B基因?qū)胫惺?號中，并提高了中薯3號的抗干旱和耐鹽能力。石虎[10]以青薯9號無菌苗為外植體，優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系獲得ERFs類轉(zhuǎn)錄因子抗性植株。本研究以馬鈴薯中薯8號微型薯和黃金薯微型薯，中薯8號無菌苗莖段和Desiree無菌苗莖段為外植體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法成功轉(zhuǎn)化馬鈴薯，并對遺傳轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化。

在馬鈴薯轉(zhuǎn)化過程中，不同品種、農(nóng)桿菌的濃度和抗生素的選擇對轉(zhuǎn)化出陽性植株很重要，這能有效去除農(nóng)桿菌侵染造成的污染和確保轉(zhuǎn)化植株的正常生長。作為遺傳轉(zhuǎn)化的材料，必須來源充足和再生穩(wěn)定，且在生長狀態(tài)最好的時間段進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。綜合以上因素，通過對馬鈴薯不同品種不同外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化分析，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯莖段轉(zhuǎn)化效率相對微型薯高，且工作量和污染相對較少。用微型薯轉(zhuǎn)化，污染較為嚴(yán)重，且需要頻繁的更換培養(yǎng)基。并且在試驗過程發(fā)現(xiàn)，最適農(nóng)桿菌濃度OD600值為0.4，OD600值大于或小于0.4，均會導(dǎo)致外植體農(nóng)桿菌污染嚴(yán)重而死亡。此外，在促進(jìn)轉(zhuǎn)化植株生根過程中發(fā)現(xiàn)，IBA的生根效果比IAA更好。

本研究獲得的轉(zhuǎn)FAD2基因馬鈴薯陽性植株進(jìn)行PCR檢測，確認(rèn)FAD2基因已經(jīng)整合到馬鈴薯中，這為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗及FAD2的功能驗證和耐凍性鑒定奠定基礎(chǔ)。