應(yīng)用RP-HPLC法測(cè)定野山杏果肉黃酮類化合物

戴小華，谷虹霏，金科旭，束佳敏，楊若藍(lán)，吳夢(mèng)嵐，潘 慧，趙紅瓊

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】野山杏〔Armeniacasibirica(L.) Lam.〕果肉中含有多種黃酮類化合物，黃酮類化合物具有多種生物活性及藥理作用。近年來對(duì)黃酮及黃酮類化合物的不同分析檢測(cè)方法進(jìn)行了多個(gè)研究，研究新疆野山杏總黃酮的提取分離方法，對(duì)開發(fā)利用新疆特色藥食同源植物提供有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)具有靈敏度高、流動(dòng)相和色譜柱選擇范圍廣、分析速度快、流出組分易收集等特點(diǎn)[1]，選擇該方法進(jìn)行成分分析較普遍。張?jiān)返萚2]研究利用高效液相法同時(shí)檢測(cè)柑橘果實(shí)中18種黃酮類化合物的含量，分離效果良好；左月明等[3]等采用RP-HPLC法在40 min內(nèi)梯度洗脫同時(shí)檢測(cè)出三白草藥材中蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物的含量；WANG等[4]在流速1.0 mL/min下梯度洗脫 25 min內(nèi)同時(shí)分離檢測(cè)冷蒿地上部分7種黃酮類化合物含量。【本研究切入點(diǎn)】關(guān)于野山杏黃酮及黃酮化合物的提取及分離方面報(bào)道較少。研究運(yùn)用高效液相色譜法，建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法，分析檢測(cè)波長、流動(dòng)相、流速、柱溫等因素確定色譜條件，運(yùn)用系統(tǒng)適用性試驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、加樣回收率實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證野山杏果肉中4種黃酮類化合物的含量分析方法。

1 材料與方法

Hubble C18(1.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；高效液相色譜系統(tǒng):島津LC-20A型高效液相色譜儀、SPD-20A型檢測(cè)器、SIL-20A型進(jìn)樣器、LC-20AT型輸液泵、CTO-20A型柱溫箱(日本島津公司)。

野山杏果實(shí)采自新疆哈密地區(qū)伊吾縣，經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥學(xué)院藥用植物實(shí)驗(yàn)室鑒定為野山杏〔Armeniacasibirica(L.)Lam.〕的干燥果肉。蘆丁(批號(hào)Y22S6S3719，純度為98%)、原花青素(批號(hào)Y22F7Y17095，純度為95%)、槲皮素(批號(hào)C20J6Y1722，純度為98%)、柚皮苷二氫查爾酮(批號(hào)H05S6K3043，純度為98%)均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇(色譜純)、磷酸(分析純)。

1.2 方 法

1.2.1 溶液制備

1.2.1.1 對(duì)照品溶液配制

稱取原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素4種對(duì)照品各(10.00±0.20)mg，用甲醇溶解并分別定容至25 mL容量瓶中，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 混標(biāo)儲(chǔ)備液

分別取上述溶液各2.50 mL，混合均勻，制得含有原花青素106.00 μg/mL、蘆丁103.00 μg/mL、柚皮苷二氫查爾酮112.00 μg/mL、槲皮素104.00 μg/mL的混標(biāo)儲(chǔ)備液。

1.2.1.3 混標(biāo)中間液及混標(biāo)工作液

準(zhǔn)確量取5 mL混標(biāo)溶液甲醇定容至10 mL，制得含有原花青素53.00 μg/mL、蘆丁51.50 μg/mL、柚皮苷二氫查爾酮56.00 μg/mL、槲皮素52.00 μg/mL混標(biāo)中間液。

分別取0.25、0.50、1.00、2.00 mL中間液甲醇定容至10 mL容量瓶，搖勻，配制標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)待測(cè)。

不同濃度的混合對(duì)照品溶液，采用優(yōu)化的色譜條件，測(cè)定新疆野山杏果肉中4種黃酮類化合物成分的峰面積，以各對(duì)照品溶液中黃酮成分濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積值為縱坐標(biāo)(y)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并計(jì)算線性回歸方程。精密移取黃酮混合對(duì)照品，并連續(xù)6次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD值。取供試品溶液，供試品溶液6份，按優(yōu)化的色譜條件，分別于0、1、2、4、6、8 h測(cè)定峰面積。取同一供試品溶液，在色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定得到峰面積。以各待測(cè)成分峰面積為指標(biāo)，計(jì)算原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素峰面積的RSD值。稱取野山杏果肉粉末1.0 g，制備供試品溶液，進(jìn)樣量10 μL。按高、中、低3個(gè)濃度水平進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)，且每個(gè)濃度平行3次。稱取6份同一野山杏果肉干燥粉末，制備供試品溶液。用微孔濾膜(0.22 μm)過濾并根據(jù)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.1.4 供試品溶液配制

取1 g野山杏干燥果肉，粉碎，過40目篩，加50%乙醇(料液比1∶50)，70℃下超聲1 h，超聲提取2次，抽濾，合并濾液旋蒸濃縮后，用甲醇定容至10 mL，搖勻，制成供試品溶液，測(cè)定前用微孔濾膜(0.22 μm) 過濾，備用。圖1

1.2.2 色譜條件的優(yōu)化

1.2.2.1 檢測(cè)波長選擇

取對(duì)照品溶液，采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)各成分吸收峰進(jìn)行掃描，通過3D圖譜對(duì)各對(duì)照品的吸收峰進(jìn)行分析，確定對(duì)照品溶液的最大吸收波長。

1.2.2.2 流動(dòng)相選擇

黃酮類化合物都微溶于水，同時(shí)溶于有機(jī)溶劑，在C18色譜柱應(yīng)用中，選用甲醇-水溶液作流動(dòng)相時(shí)分離黃酮類化合物效果最佳。根據(jù)待測(cè)物的理化性質(zhì)及文獻(xiàn)報(bào)道[5]，采用甲醇-磷酸水溶液作為流動(dòng)相。

1.2.2.3 流速選擇

在固定相和流動(dòng)相不變的情況下，分析0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 4種不同流速下色譜峰分離情況。

1.2.2.4 柱溫選擇

在流動(dòng)相和固定相不變的情況下，分別在25、30、35℃下，以出峰時(shí)間為測(cè)定依據(jù)，分析不同柱溫對(duì)色譜峰的影響。

1.2.2.5 色譜條件

取各對(duì)照品溶液、供試品溶液、溶劑空白依次進(jìn)樣，原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素4種黃酮類化合物均在270 nm左右有共同的吸收峰帶，經(jīng)分析比照后得到對(duì)照品混合溶液最大吸收波長為273 nm。圖1

Hubble C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相A(甲醇)∶B(0.5%磷酸水溶液)=45∶55，以1.0 mL/min流速進(jìn)行等度洗脫，柱溫箱溫度為35℃，檢測(cè)波長為273 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、SigmaPlot 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性

研究表明，溶劑空白和對(duì)照品、樣品溶液無干擾作用，則檢測(cè)條件符合要求。圖4～6

圖2 不同流速下各黃酮成分保留時(shí)間變化Fig.2 Effect of different flow rateon the retention time of different flavonoids

圖3 不同溫度下各黃酮成分保留時(shí)間變化Fig.3 Effect of different temperature the retention time of different flavonoids

圖4 溶劑空白色譜峰Fig.4 Chromatogram of Solvent

注：1.原花青素；2.蘆?。?.柚皮苷二氫查爾酮；4槲皮素

注：1.原花青素；2.蘆??；3.柚皮苷二氫查爾酮；4槲皮素

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

研究表明，野山杏果實(shí)中原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素在各自濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。表1

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(n =6)Table 1 Quation of standard curve line(n=6)

2.3 精密度

研究表明，原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素峰面積分別為0.88%、0.14%、0.14%、0.44%(n=6)。表2

表2 精密度(n =6)Table 2 Result of Precision experiment(n=6)

2.4 穩(wěn)定性

研究表明，供試品溶液的色譜峰面積沒有明顯改變。原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素峰面積的RSD值分別為1.82%、0.77%、未檢出、1.93%(n=6)，原花青素、蘆丁和槲皮素穩(wěn)定性良好。表3

表3 穩(wěn)定性(n =6)Table 3 Result of stability experiment(n=6)

2.5 重復(fù)性

研究表明，原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素峰面積的RSD值分別為1.88%、2.69%、未檢出、3.31%(n=6)，該方法檢測(cè)原花青素、蘆丁和槲皮素重復(fù)性較好。表4

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n =6)Table 4 Result of reproducibility experiment(n=6)

2.6 加樣回收率

研究表明，除柚皮苷未檢出，槲皮素低、中組未檢出，各黃酮類化合物成分的加樣回收率在92.13%～96.70%，黃酮類化合物成分原花青素和蘆丁的回收率良好。表5

2.7 樣品含量

研究表明，新疆野山杏果肉中4種黃酮類化合物成分的含量，其中柚皮苷未檢出，槲皮素、原花青素、蘆丁含量不等，其中原花青素含量最高。表6

表5 樣品加標(biāo)回收率(n =3) Table 5 Result of recovery experiment(n=3)

表6 野山杏果肉黃酮成分含量(n =6)Table 6 Result of component content determination of flavonoids in TFWA(n=6)

3 討 論

野山杏果肉中含有豐富的黃酮類化合物，但不同地區(qū)以及不同部位黃酮的含量和種類有一定差異，用RP-HPLC法分析野山杏黃酮類成分的報(bào)道較少。閆偉偉等[6]建立了杏花藥材(HPLC)指紋圖譜測(cè)定方法并對(duì)不同產(chǎn)地的杏花藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，張麗麗等[7]采用高效液相色譜法測(cè)定了5個(gè)杏品種果肉中的可溶性糖和有機(jī)酸，張玲等[8]采用HPLC定量分析方法對(duì)3個(gè)仁用杏品種杏仁中的苦杏仁苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了檢測(cè), 韓海霞等[9]利用HPLC法測(cè)定了新疆巴旦杏中苦杏仁苷的含量；羅慧玉等[10]利用HPLC法測(cè)定了杏花中阿魏酸、蘆丁和異槲皮苷的含量，其中蘆丁的含量為3.080～6.933 mg /g，張?jiān)返萚11]研究利用高效液相法同時(shí)檢測(cè)柑橘果實(shí)中18種黃酮類化合物的含量，具有良好的分離效果。左月明等[12]等采用RP-HPLC法在40 min內(nèi)梯度洗脫同時(shí)檢測(cè)出三白草藥材中蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物的含量。實(shí)驗(yàn)測(cè)定的蘆丁含量高于文獻(xiàn)報(bào)道的，故進(jìn)一步說明不同部位黃酮的含量和種類有一定差異。

在對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行選擇時(shí)，實(shí)驗(yàn)初步選擇水-甲醇系統(tǒng)作為流動(dòng)相，混合對(duì)照品溶液中各成分色譜峰分離效果不佳，后加入磷酸進(jìn)行調(diào)節(jié)，直到調(diào)節(jié)到流動(dòng)相V甲醇∶V 0.5%磷酸溶液=45∶55時(shí)，4種黃酮類化合物成分色譜峰在20 min內(nèi)完全分離，峰形對(duì)稱且分離度良好。

實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的4種成分為3種不同類型的黃酮類化合物，即黃酮醇類、查爾酮類、花色素類，如若要測(cè)定野山杏更多類型的黃酮類化合物可在實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相為V甲醇∶V 0.5%磷酸溶液=45∶55的基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)流動(dòng)相配比，必要時(shí)進(jìn)行梯度洗脫，就可進(jìn)一步建立測(cè)定分析野山杏多種黃酮化合物成分及含量的方法。

在各黃酮類化合物成分的含量檢測(cè)中，由于柚皮苷二氫查爾酮在野山杏中含量極低，低于檢測(cè)限，故在含量檢測(cè)時(shí)未檢出，在研究過程中進(jìn)一步探討同時(shí)測(cè)定柚皮苷二氫查爾酮含量的最優(yōu)條件。

4 結(jié) 論

采用RP-HPLC法分析了新疆野山杏果肉中的原花青素、蘆丁、柚皮苷二氫查爾酮、槲皮素等4種黃酮類化合物，其中原花青素、蘆丁、槲皮素3種黃酮成分色譜峰在20 min內(nèi)分離度良好，線性范圍為0.52～56 μg/mL(r= 0.999 8～1)，加樣回收率為92.13%～96.70%，RSD為0.89%～1.96%，在該條件下測(cè)得的原花青素的含量為7.325 mg/kg，蘆丁的含量為0.630 mg/kg，槲皮素的含量為0.009 58 mg/kg，3種黃酮類化合物中原花青素含量最高；一種黃酮類化合物即柚皮苷二氫查爾酮在該條件下未檢出。RP-HPLC法可對(duì)新疆野山杏果肉中3種黃酮類化合物成分進(jìn)行分析，該法簡便、準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定性及重復(fù)性好，可為野山杏中黃酮類化合物的快速檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。