三七皂苷R1對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的作用機制

方芳 范虹 樊光輝*

動脈粥樣硬化（AS）是誘發(fā)心腦血管病的主要病理基礎，目前與其相關的心腦血管疾病發(fā)病率呈年輕化，且有持續(xù)上升的趨勢［1］。雖然經(jīng)皮冠脈支架植入術、冠脈搭橋術能對病變血管行再次血運重建，但最終還是不能干預AS 病理進程。隨著調(diào)脂、抗血小板聚集等藥物的臨床應用，動脈粥樣硬化的病死率雖有所下降，但存在一定的不良反應，預后不理想。因此采取安全、積極、有效措施干預AS，對防治心血管事件具有十分重要的現(xiàn)實意義。三七是祖國醫(yī)學經(jīng)典的活血化瘀代表藥物之一，具有抗炎、抗氧化、提高免疫力等諸多藥理作用［2］。三七皂苷R1（NR1）是三七的主要活性單體之一，不僅具有調(diào)節(jié)血壓、保護心肌、改善缺血缺氧性腦病的多重功效，還有毒副作用小、多靶點、整體調(diào)節(jié)的獨特優(yōu)勢［3］。本研究以Ang Ⅱ誘導ApoE-/-小鼠，建立動脈粥樣硬化模型，觀察NR1 對AS 斑塊的作用，以期為中醫(yī)藥有效防治血管類疾病提供重要的實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 三七皂苷R1（110745，中國藥品生物制品檢定所）；血管緊張素Ⅱ（Sigma，USA）；微泵（Alzet Model 2004，USA）。

1.2 實驗動物及飼料 8～10 月齡雄性ApoE-/-小鼠（40只）購自武漢大學動物實驗中心，體質(zhì)量約22～33 克；飼養(yǎng)于武漢大學動物實驗中心SPF 級動物房，予以正常實驗飲食（D12450B，北京華阜康生物科技有限公司）。

1.3 主要試劑及儀器 油紅O 溶液（O1391～250ML，Sigma）；伊紅染液（水溶性）（BA-4024，BASO）；蘇木素染液（G1004，武漢賽維爾生物科技有限公司）；Elisa 試劑盒（PMTA00B for TNF-α，PMLB00C for IL-1，PM6000B for IL-6，PMJE00 for MCP1）（R&D Systems）；SMA抗體：Rabbit polyclonal to mouse alpha smooth muscle Actin（ab5694 1：100，Abcam）；超速離心機（XL-90，美國Beckman 公司）；體視顯微鏡（SZ61，OLYMPUS）。

1.4 分組及模型制備 40 只ApoE-/-小鼠予普通飼料喂養(yǎng)1周，隨機分為給藥組和對照組，每組各20只。兩組均皮下植入含有血管緊張素Ang Ⅱ［1000 ng/（kg·min）］微泵，持續(xù)誘導4 周，建立AS 模型［4］。造模第2 天，給藥組將三七皂苷R1 粉末溶于無菌生理鹽水中，配制濃度為2.5 mg/mL，腹腔注射NR1 25 mg/（kg·d）；對照組：每日腹腔注射與NR1 等體積的生理鹽水。

1.5 實驗方法（1）小鼠體質(zhì)量監(jiān)測及生化檢查：術前1 周、術后1、2、4 周，通過測量小鼠體質(zhì)量，調(diào)整NR1 腹腔注射量。于末次給藥24 h 后，乙醚麻醉小鼠后從眼眶采血，4000 r/min，離心30 min，取血清并稀釋2.5 倍后檢測血脂TC、TG、LDL-C、HDL-C，檢測由MODULAR 全自動生化鑒定儀完成。（2）血清炎癥因子檢測：按上述方法提取小鼠血清并稀釋2.5 倍后，參照 ELISA 試劑盒說明書，分步檢測血清炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β 和MCP-1）水平。（3）組織病理學檢測：3%戊巴比妥鈉（90 mg/kg）腹腔注射麻醉，分離小鼠主動脈，盡量保留主動脈弓分支，剝除外膜脂肪。石蠟標本：4%多聚甲醛中固定>24 h，石蠟包埋，主動脈根部和頭臂干切片行HE 染色，光鏡下觀察拍片，Image-Pro Plus 5.0 圖像分析測定單位壞死中心面積。冰凍標本：4%多聚甲醛中固定24 h，20%蔗糖溶液中脫水過夜，冰凍切片包埋劑進行包埋，將主動脈樹進行油紅O 染色，完成拍照，使用Image Pro Plus 6.0 軟件統(tǒng)計損傷面積。主動脈根部行免疫熒光檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布計量資料以（）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NR1 對小鼠體質(zhì)量的影響 見表1。

表1 兩組小鼠各階段體質(zhì)量比較［g，（）］

表1 兩組小鼠各階段體質(zhì)量比較［g，（）］

2.2 NR1 對小鼠血脂的影響 見表2。

表2 兩組實驗小鼠治療前后血脂比較［mg/dL，（）］

表2 兩組實驗小鼠治療前后血脂比較［mg/dL，（）］

注：與同組治療前比較，#P<0.05，##P<0.01；與對照組治療后比較，**P<0.01

2.3 NR1 對小鼠主動脈斑塊的影響 Ang Ⅱ皮下微泵誘導小鼠4 周，取主動脈行HE 染色、油紅O 染色，兩組小鼠可見大量粥樣硬化斑塊形成，表明AS 建模成功。斑塊主要集中于主動脈根部及頭臂干。HE 染色，光鏡下選取6 個視野拍片發(fā)現(xiàn)，給藥組比對照組可縮小主動脈根部（見圖1）、頭臂干（見圖2）單位壞死中心面積（P<0.01）。通過主動脈油紅O 染色，計算陽性染色區(qū)域所占主動脈的百分比。對照組脂滴顆粒狀堆積并融合成片；給藥組脂滴數(shù)量降低，體積明顯減小，呈小顆粒、片狀、稀疏分布。給藥組在減少斑塊面積，降低脂質(zhì)積聚方面優(yōu)于對照組（P<0.05）。見圖3。

圖1 兩組小鼠主動脈根部單位壞死中心面積比較（HE染色，×100）

圖2 兩組小鼠頭臂干單位壞死中心面積比較（HE染色，×100）

圖3 兩組小鼠主動脈斑塊形成比較（油紅O染色）

2.4 NR1 對斑塊內(nèi)平滑肌細胞的影響 免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，給藥組能明顯增加AS 斑塊中VSMC 的含量（α-SMA 陽性細胞為綠色）。見圖4。

圖4 兩組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)α-SMA含量比較

2.5 NR1 對循環(huán)中炎性因子水平的影響 與對照組比較，給藥組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1 和MCP-1 的含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05 或P<0.01）。見圖5。

圖5 兩組小鼠治療后血清TNF-α、IL-6、IL-1和MCP-1濃度比較

3 討論

血脂異常是目前公認與AS高度關聯(lián)的重要危險因素之一［5］。研究發(fā)現(xiàn)，高LDL-C 不僅影響斑塊體積，且可通過氧化反應轉變成ox-LDL，被巨噬細胞攝取后引起膽固醇積聚、斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量增加，介導不穩(wěn)定性斑塊進展［6］。VSMCs 在AS 發(fā)展中具有重要作用，其遷移密度與進展期斑塊脂核上纖維帽的厚度明顯相關［7］。提示斑塊穩(wěn)定性與血脂水平、VSMCs 含量緊密相關。本研究結果顯示，NR1 能減輕AS 斑塊的形成，同時還可減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)的積聚，降低血清TG、LDL-C 水平。免疫熒光檢測平滑肌肌動蛋白（α-SMA）含量顯示，α-SMA 在治療組中陽性表達量高于對照組，提示NR1能夠通過降脂，干預AS 危險因素抗動脈粥樣硬化，并可能通過增加AS 斑塊中VSMCs 數(shù)量來增加斑塊的穩(wěn)定性。

動脈粥樣硬化是漸進發(fā)展的動脈血管炎性疾?。?］。持續(xù)皮下作用Ang Ⅱ不但可促進外膜成纖維細胞炎性因子的表達，且還是巨噬細胞趨化、黏附、極化的重要調(diào)控因素；Ang Ⅱ通過促炎，加速小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成［9］。TNF-α 表達增加可促進斑塊中炎癥反應，加速粥樣斑塊進展［10］。IL-6 濃度升高與AS 斑塊不穩(wěn)定性相關，主要通過促進血小板活化，加速凝血進程，其與TNF-、Ang Ⅱ相互影響，是誘發(fā)心血管疾病的三項主要危險因素［11］。IL-1 在內(nèi)皮細胞內(nèi)表達，可引起VCAM-1 水平升高、單核細胞黏附聚集而影響動脈粥樣硬化進程［12］。MCP-1 聚集、誘導單核巨噬細胞吞噬ox-LDL，因泡沫細胞的形成而促進脂質(zhì)不斷積聚［13］。故炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1 和MCP-1 是影響動脈粥樣硬化的敏感指標。本研究結果顯示，三七皂苷R1能降低AS 小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1、MCP-1 水平，提示三七皂苷R1 抗動脈粥樣硬化作用與抑制外周循環(huán)炎性因子的表達相關。

綜上所述，三七皂苷R1 具有抗Ang Ⅱ誘導ApoE-/-小鼠AS 的作用，其機制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥因子的激活和改變斑塊內(nèi)組分等相關?；贜R1 可減少AS 斑塊的脂質(zhì)負荷并增加斑塊內(nèi)平滑肌細胞的含量，今后可進一步探討NR1 對斑塊穩(wěn)定性的影響，尋求促使VSMCs 轉化為有利表型的安全、有效治療策略，對于防治AS 具有重要臨床意義。