體外受精患者卵泡液高密度脂蛋白顆粒組分與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性分析

雷承泳，周志偉，段 彪，羅朝霞，馮 清

（贛州市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，江西 贛州 341000）

卵泡液（follicular fluid，F(xiàn)F）為卵母細(xì)胞發(fā)育提供微環(huán)境，在卵泡生長、卵母細(xì)胞成熟和排卵等過程中發(fā)揮重要作用[1]。研究顯示[2]，卵泡液包括顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的分泌物和活性成分、毛細(xì)血管擴(kuò)散的血清、透過血卵泡屏障的血漿組分等成分，卵泡液成分的變化對卵泡發(fā)育和體外受精-胚胎移植（IVF-ET）胚胎質(zhì)量具有重要影響。為改善IVF 妊娠結(jié)局、減少母嬰并發(fā)癥，找到卵泡液中與胚胎質(zhì)量的相關(guān)的組分用于胚胎質(zhì)量的有效預(yù)測，進(jìn)行選擇性單胚胎移植就顯得尤為重要。本研究以卵泡液中高密度脂蛋白（HDL）顆粒組分為切入點(diǎn)，探討其與卵裂期胚胎質(zhì)量的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2019 年8 月-2020 年3 月在贛州市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科接受IVF-ET 助孕的不孕婦女為研究對象，共提取504 份卵泡液樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～40 歲，有固定配偶、未分居、規(guī)律性生活、無避孕措施、無哺乳、有生育意愿但≥12 月以上未獲得臨床妊娠；②符合《衛(wèi)生部關(guān)于修訂人類輔助生殖技術(shù)及人類精子庫相關(guān)技術(shù)規(guī)范、基本標(biāo)準(zhǔn)和倫理原則》中IVF-ET的適應(yīng)證，如輸卵管因素不孕、排卵障礙型不孕、子宮內(nèi)膜異位癥、女性免疫性不孕或不明原因不孕[3]；③夫妻雙方情況滿足并采用常規(guī)體外受精的受精方式；④無吸煙、飲酒等不良嗜好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①女方既往存在不良孕產(chǎn)史或合并生殖系統(tǒng)畸形、子宮內(nèi)膜病變、引起宮腔形態(tài)變化的子宮腺肌病者；②女方合并甲狀腺、腎上腺、垂體等器質(zhì)性病變及其他內(nèi)分泌疾病影響妊娠者；③女方合并糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、急性活動性肝炎、肝硬化、急性腎炎、慢性腎功能不全等疾病者；④男女任何一方患有泌尿系統(tǒng)急性感染、性傳播疾病者；⑤與妊娠結(jié)局相關(guān)的染色體異常者；⑥男女任何一方具有吸毒等不良嗜好或接觸致畸量的放射線、藥物、毒品并處于作用期者；⑦男女任何一方存在精神疾病、認(rèn)知功能障礙，不能正確理解研究內(nèi)容者；⑧平行參加其他臨床研究者；⑨促排卵期間出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，需要退出研究或患者強(qiáng)烈要求退出研究者。根據(jù)胚胎質(zhì)量將樣本分為優(yōu)質(zhì)胚胎組（n=266）和非優(yōu)質(zhì)胚胎組（n=238）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理會批準(zhǔn)，患者及配偶對研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集研究對象的年齡、體重、不孕年限、不孕因素、不孕類型、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、基礎(chǔ)E2、基礎(chǔ)P、基礎(chǔ)PRL、Gn 量、獲卵數(shù)、受精率、卵裂率、可移植胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率等重要臨床資料。

1.2.2 體外受精 采用常用的早卵泡期長方案進(jìn)行促排卵[4]。在月經(jīng)來潮第2～3 天肌肉注射促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a）［注射用醋酸亮丙瑞林微球（上海麗珠制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20093852），規(guī)格：3.75 mg/支］3.75 mg，28～30 d 后行B 超及內(nèi)分泌檢查。若垂體完全降調(diào)節(jié)（子宮內(nèi)膜厚度≤5 mm，血清FSH＜5 mIU/ml，LH＜5 mIU/ml，E2＜50 pg/ml），開始給予促性腺激素（Gn）［重組人促卵泡液激素注射液（默克雪蘭諾有限公司，進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JS20160044），規(guī)格：300 IU/支］75～300 IU/d 啟動超促排卵周期，5 d 后B 超監(jiān)測卵泡生長大小，并監(jiān)測血清激素水平，根據(jù)卵泡生長發(fā)育速度調(diào)整Gn 用量，直至HCG 注射日止。當(dāng)至少有1 個卵泡直徑≥19 mm 或2 個卵泡直徑≥18 mm 時(shí)，于當(dāng)晚給予HCG（默克雪蘭諾有限公司，批號：S20110045，規(guī)格：250 μg/支）250 μg 皮下注射，36 h后在陰道B 超引導(dǎo)下取卵。取卵過程：術(shù)前30 min肌注酮咯酸氨丁三醇注射液（山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20052634，規(guī)格：30 mg）30 mg，排空膀胱，取膀胱截石位，用生理鹽水沖洗外陰和陰道并擦干，鋪消毒巾，在陰道探頭外罩以無菌橡膠套，安置穿刺架。用生理鹽水徹底沖洗探頭套和手術(shù)者手套，擦干，用培養(yǎng)液沖洗穿刺針，將探頭置入陰道內(nèi)，探查兩側(cè)卵巢，連接負(fù)壓吸引器，維持負(fù)壓100～120 mmHg，采用16 G～17 G的單腔取卵針通過探頭導(dǎo)向器在穿刺引導(dǎo)線的指示下，經(jīng)陰道穹窿部進(jìn)針。進(jìn)針前，先確認(rèn)患者雙側(cè)卵巢位置、卵泡數(shù)目及大小，同時(shí)注意周圍大血管的分布，小心避開盆腔中膀胱、血管、腸管等以防止出血及其它事故的發(fā)生，由近至遠(yuǎn)依次穿刺所有直徑≥14 mm的卵泡，每次只穿刺一個卵泡。抽取的卵泡液快速送入胚胎實(shí)驗(yàn)室采集皿中，之后在顯微鏡下尋找卵泡液中的卵-冠-丘復(fù)合體，漂洗掉復(fù)合體表面附著的血液和碎片，將漂洗處理過的卵-冠-丘復(fù)合體放入提前配好的受精培養(yǎng)液中，然后置于6%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～6 h 后進(jìn)行常規(guī)體外受精。同時(shí)收集卵泡液，以1800 r/min 速度離心10 min，取上清液，分成1 ml/份在-20 ℃保存。取卵術(shù)后予以抗生素防止感染，給予黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H33020828，規(guī)格：10 mg）進(jìn)行黃體支持，為移植日做準(zhǔn)備。進(jìn)行治療的男方取精前2～7 d 不能同房，與女方取卵同日取精，取精前排空膀胱，洗凈雙手及尿道口，以手淫的方式將采集的精液盛放于無菌的容器中。取精日突發(fā)取精困難或存在勃起障礙影響取精者：給予心理暗示、影音刺激、配偶協(xié)助求精或口服西地那非（輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020528，規(guī)格：100 mg），或給予直腸前列腺按摩取精，或行睪丸細(xì)針抽吸術(shù)取精[5]。收集的精液置于恒溫裝置上，待其液化后用無菌吸管吹打混勻，然后按本科室常規(guī)方案進(jìn)行精液優(yōu)化處理，獲取的精子懸液標(biāo)本置于6%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h 左右。常規(guī)的體外受精是將卵子和精子放入同一培養(yǎng)皿中（根據(jù)加入的卵子數(shù)來確定加入的精子數(shù)），培養(yǎng)16～18 h 開始觀察卵子的受精狀況，再培養(yǎng)24～48 h觀察胚胎質(zhì)量情況。

1.2.3 胚胎質(zhì)量判定 受精后第3 天根據(jù)形態(tài)學(xué)特征對卵裂期胚胎進(jìn)行質(zhì)量評分，分為4 個等級[6]。1 級：胚胎細(xì)胞數(shù)為7～9 個，細(xì)胞大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整；胞質(zhì)均勻清晰，沒有顆粒現(xiàn)象；碎片比例≤5%。2 級：胚胎細(xì)胞數(shù)≥6 個，細(xì)胞大小略不均勻，形狀略不規(guī)則；胞質(zhì)有顆粒現(xiàn)象；碎片比例占5%～20%；胞漿有1～2 個空泡存在。3 級：胚胎細(xì)胞數(shù)≥4 個，細(xì)胞大小明顯不均勻，有明顯的形態(tài)不規(guī)則；胞質(zhì)有明顯顆?，F(xiàn)象；碎片在21%～50%；胞漿中出現(xiàn)少量空泡。4 級：胚胎細(xì)胞數(shù)≥2 個，細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻；形狀完全不規(guī)則，胞質(zhì)有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象；碎片在50%以上，或50%以上的空泡。其中第3 天質(zhì)量評分為1 級、2 級且細(xì)胞數(shù)為7、8、9 個，碎片比例≤10%的正常受精胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。第3 天質(zhì)量評分為1 級、2 級且細(xì)胞數(shù)≥6 個的正常受精胚胎定義為可移植胚胎。

1.2.4 卵泡液相關(guān)成分檢測 ①采用免疫比濁法測定載脂蛋白A1（ApoA1）和載脂蛋白B（ApoB）水平；②采用免疫印跡法[7]測定HDL 亞類，各亞類的相對百分含量再與樣品中ApoA1的含量相乘，即為HDL各亞類的含量；③采用人活性氧ELISA 試劑盒檢測活性氧（ROS）含量，采用總抗氧化能力試劑盒檢測卵泡液總抗氧化能力（TAC）水平。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察優(yōu)質(zhì)胚胎組和非優(yōu)質(zhì)胚胎組卵泡液中ApoA1、HDL 亞類水平，分析其與卵裂期胚胎質(zhì)量是否存在相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)性分析，多因素分析采用Logistic 回歸分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料 納入504 份卵泡液樣本，來自110例助孕患者。年齡24～37 歲，平均年齡（29.93±3.28）歲；體重指數(shù)16.36～26.67 kg/m2，平均體重指數(shù)（21.54±2.28）kg/m2；不孕年限1～9 年，平均不孕年限（2.65±1.59）年。不孕因素：盆腔輸卵管因素79例，占71.81%；不明原因不孕21例，占19.09%；排卵障礙6例，占5.45%；多囊卵巢綜合癥3例，占2.73%；男方因素8例，占7.27%。不孕類型：原發(fā)性不孕46例，占41.82%；繼發(fā)性不孕64例，占58.18%?；A(chǔ)FSH（16.16±2.13）mIU/ml；基礎(chǔ)LH（5.83±2.12）mIU/L；基礎(chǔ)E2（175.34±62.55）pmol/L；基礎(chǔ)P（0.31±0.13）ng/ml；基礎(chǔ)PRL（17.61±6.10）ng/ml；Gn 量（2649.09±989.98）IU。

2.2 獲卵數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎率 獲卵6～17 枚，平均獲卵（10.35±3.07）枚，共獲卵子1138 枚，受精1028 枚，受精率為90.33%；卵裂1018 枚，卵裂率為99.03%；可移植胚胎504 枚，可移植胚胎率為49.51%；優(yōu)質(zhì)胚胎266 枚，優(yōu)質(zhì)胚胎率為25.88%。

2.3 兩組檢查指標(biāo)比較 兩組ROS、TAC、ApoA1、ApoB、preβ1-HDL、HDL3c、HDL3b、HDL3a、HDL2a、HDL2b 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組檢查指標(biāo)比較（）

表1 兩組檢查指標(biāo)比較（）

2.4 卵泡液中檢查指標(biāo)與優(yōu)質(zhì)胚胎的相關(guān)性分析Spearman 相關(guān)分析顯示，卵泡液中preβ2-HDL 水平與優(yōu)質(zhì)胚胎無相關(guān)性（P＞0.05），卵泡液中ROS、ApoB、preβ1-HDL、HDL3c、HDL3b 水平與胚胎質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），ApoA1、HDL3a、HDL2a、HDL2b、TAC 水平與胚胎質(zhì)量呈正相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 卵泡液中檢查指標(biāo)與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性分析

2.5 影響優(yōu)質(zhì)胚胎的多因素Logistic 回歸分析 將單因素分析中 ApoA1、ApoB、preβ1-HDL、HDL3c、HDL3b、HDL3a、HDL2a、HDL2b、ROS、TAC 進(jìn)行自變量賦值（X1～X10，連續(xù)變量），以可移植胚胎是否為優(yōu)質(zhì)胚胎為因變量，進(jìn)行多因素Logistic 分析，結(jié)果顯示ApoA1、HDL2b、ApoB 為胚胎質(zhì)量的影響因素（P＜0.05），見表3。

表3 影響優(yōu)質(zhì)胚胎的多因素Logistic 回歸分析

3 討論

目前ART的臨床實(shí)踐中已經(jīng)建立了多種胚胎質(zhì)量評估的方法，包括形態(tài)學(xué)、代謝組學(xué)和基因組學(xué)等[8]。卵泡液是卵母細(xì)胞發(fā)育的重要環(huán)境，其成分包括血液透過血卵泡屏障的血漿成分、顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的分泌物和活性成分等，與外周血液相比較，卵泡液與卵母細(xì)胞的聯(lián)系更為緊密，可直接影響卵母細(xì)胞的發(fā)育過程和受精能力，卵泡液成分的變化直接影響卵母細(xì)胞的形態(tài)和胚胎質(zhì)量[9]。

氧對于細(xì)胞的生存至關(guān)重要，但正常氧代謝產(chǎn)生的活性氧水平升高可損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，從而影響細(xì)胞功能。機(jī)體內(nèi)對抗ROS的總能力稱為TAC，包括各種抗氧化分子和抗氧化酶系統(tǒng)，正常情況下卵泡內(nèi)氧化和抗氧化體系處于動態(tài)平衡，如果抗氧化物減少和（或）ROS 增多，則可導(dǎo)致卵泡內(nèi)ROS 過度積累，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞質(zhì)量。Várnagy á 等[10]研究顯示，IVF 過程中卵母細(xì)胞受精率降低與TAC 降低有關(guān)。有研究證實(shí)[11]，退化的卵母細(xì)胞中ROS的積累增加，導(dǎo)致了包括DNA、蛋白和脂質(zhì)的氧化損傷，最終誘導(dǎo)了細(xì)胞周期停滯及減數(shù)分裂中非整倍體的產(chǎn)生。Liu Y等[12]發(fā)現(xiàn)多囊卵巢患者較輸卵管因素不育患者的大多數(shù)卵不具備減數(shù)分裂紡錘體，ROS 水平高而TAC水平低，受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、臨床妊娠率隨之下降。但研究顯示[13]，卵泡TAC 水平與妊娠結(jié)局參數(shù)無明顯影響。Yilmaz N 等[14]報(bào)道中顯示非妊娠組卵泡液中TAC 水平高于妊娠組。本研究雖然觀察到優(yōu)質(zhì)胚胎組ROS 降低和TAC 水平升高，但多因素分析的結(jié)果并未觀察到ROS 和TAC 與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性，這樣的結(jié)果可能與患者個體差異、研究方法和樣本數(shù)等有關(guān)，但同時(shí)也提示可能存在其他的影響因素，還需要進(jìn)一步研究探討。

HDL 是復(fù)雜的多功能蛋白復(fù)合體，多數(shù)研究集中于心血管領(lǐng)域，而生殖領(lǐng)域缺乏相關(guān)研究。Rincón JAA 等[15]闡述了HDL 作為FF 中占主導(dǎo)地位的脂蛋白，其具有促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的生理功能，有助于維持卵泡液中膽固醇平衡，對卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育起著重要作用，同時(shí)HDL 還具有抗炎和抗氧化活性，其抗氧化活性與脂質(zhì)組合物、載脂蛋白ApoA1、結(jié)構(gòu)修飾等相關(guān)。該研究的結(jié)果表明卵泡液中的ApoA1 水平與胚胎的卵裂率無關(guān)，但與胚胎的碎片化呈負(fù)相關(guān)，影響胚胎發(fā)育質(zhì)量。既往研究數(shù)據(jù)顯示[16]，卵泡液中HDL 及其組成脂蛋白ApoA1 可能對人類卵母細(xì)胞質(zhì)量及隨后的早期胚胎發(fā)育起保護(hù)作用，同時(shí)ApoA1 還與空卵泡刺激綜合征的低發(fā)生率相關(guān)。HDL組分中的ApoA1 還通過促進(jìn)膽固醇和磷脂從外周組織轉(zhuǎn)移到新生盤狀HDL，激活卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶（LCAT），LCAT 是膽固醇酯化和最終HDL 顆粒成熟必需的酶，在HDL 重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。LCAT 催化膽固醇酯化，使小顆粒preβ1-HDL 轉(zhuǎn)變?yōu)镠DL3，然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒烨驙畲箢w粒HDL2。ApoA1 含量增加時(shí)，會降低小顆粒的亞類preβ1-HDL 水平，使大顆粒的亞類增加，尤其大顆粒的HDL2b 增加最為明顯。ApoA1 作為HDL的關(guān)鍵蛋白組分，在HDL 結(jié)構(gòu)重塑和抗氧化特性中發(fā)揮主要作用，HDL 功能的實(shí)現(xiàn)與ApoA1密不可分，卵泡液中ApoA1 可能對人類卵母細(xì)胞質(zhì)量及隨后的早期胚胎發(fā)育中起保護(hù)作用。

綜上所述，HDL 顆粒組分ApoA1、HDL2b 含量水平與IVF 卵裂期胚胎質(zhì)量相關(guān)，對卵裂期胚胎質(zhì)量具有一定的預(yù)測價(jià)值，其具體作用機(jī)制尚不清楚，且缺少相關(guān)基礎(chǔ)研究，需進(jìn)一步的研究探討。