CD4 單陽參考品輔助檢測九色標(biāo)記人血樣品的流式分析技術(shù)

徐曉雪

（首都醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，北京 100069）

流式細(xì)胞術(shù)是利用流體聚焦原理，高速檢測流體中單個細(xì)胞或微顆粒多種熒光標(biāo)記參數(shù)的技術(shù)，具有高速、定量、單細(xì)胞多參數(shù)的特點，常用來分析血液細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等復(fù)雜細(xì)胞群體中多種細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)差異，可以幫助醫(yī)學(xué)工作者了解細(xì)胞的分化、增殖和功能狀態(tài)[1]。隨著流式細(xì)胞儀的發(fā)展和標(biāo)記熒光的豐富，流式檢測可以同時檢測的指標(biāo)不斷增多，流式多參數(shù)檢測使檢測數(shù)據(jù)的信息量成倍增加，不同檢測指標(biāo)可以互相印證，數(shù)據(jù)可靠度大幅提升。同時還可以節(jié)省實驗樣品和試劑，減少樣品制備步驟、大大提高流式實驗的效率，成為流式技術(shù)的重要發(fā)展方向，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。目前，已經(jīng)出現(xiàn)了超過20～30 色的流式分析方案，多參數(shù)流式技術(shù)是醫(yī)學(xué)科研與臨床中重要的單細(xì)胞分析技術(shù)之一[2]。但是，多參數(shù)流式技術(shù)檢測影響因素復(fù)雜，各項檢測參數(shù)調(diào)節(jié)范圍大，操作主觀性強，常規(guī)簡單分析的手動調(diào)節(jié)方式無法滿足檢測要求，需要更加客觀科學(xué)的設(shè)定檢測參數(shù)才能獲得理想的結(jié)果?；诖耍疚囊訤ACSymphony 流式細(xì)胞儀檢測九色標(biāo)記人外周血實驗為例，詳細(xì)介紹在多參數(shù)流式儀上客觀分析多色樣品的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 多種熒光標(biāo)記CD4 抗體參考品試劑盒，BV480 標(biāo)記CD3 抗體，BUV395 標(biāo)記CD4 抗體，PERCPCY5.5 標(biāo)記CD8 抗體，PECY7 標(biāo)記CD25抗體，BV711 標(biāo)記CD27 抗體，BB515 標(biāo)記CD45RA抗 體，APC-R700標(biāo)記CD56抗體，AF647標(biāo)記CD127 抗體，BV786CD197 抗體，溶血素，染色緩沖液，洗滌緩沖液，流式染色緩沖液，CST 質(zhì)控微球（以上試劑購自美國BD 公司）。材料：人靜脈血5 ml，采自健康志愿者。

1.2 主要儀器 BD FACSymphony 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司），臺式冷凍離心機Allegra X-15R（美國貝克曼公司）。

1.3 樣品制備

1.3.1 人外周血全血細(xì)胞表面抗體標(biāo)記九色樣品制備取200μl 全血，加入推薦用量的BV480 標(biāo)記CD3抗體，BUV395標(biāo)記CD4抗體，PERCPCY5.5標(biāo)記CD8 抗體，PECY7 標(biāo)記CD25 抗體，BV711 標(biāo)記CD27抗體，BB515 標(biāo)記CD45RA 抗體，APC-R700 標(biāo)記CD56 抗體，AF647 標(biāo)記CD127 抗體，BV786CD197抗體和染色緩沖液，室溫避光孵育30 min，加入5 ml溶血素，室溫溶血10 min，離心洗滌300 g，5 min，2次，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl。

1.3.2 九色單陽樣品與空白對照制備 每個單陽樣品管加入200 μl 全血，分別加入推薦用量的BV480標(biāo)記CD3 抗體，BUV395 標(biāo)記CD4 抗體，PERCPCY5.5 標(biāo)記CD8 抗體，PECY7 標(biāo)記CD25 抗體，BV711 標(biāo)記CD27 抗體，BB515 標(biāo)記CD45RA 抗體，APC-R700 標(biāo)記CD56 抗體，AF647 標(biāo)記CD127 抗體，BV786CD197 抗體和染色緩沖液，室溫避光孵育，溶血素，離心洗滌同上，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl。另取200 μl 全血樣品，不加入熒光抗體，僅溶血素，離心洗滌同上，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl，作為空白樣品。

1.3.3 人外周血全血細(xì)胞九色CD4 單標(biāo)樣品制備每個單陽樣品管加入200 μl 全血，分別加入與檢測樣品相同熒光素標(biāo)記的參考品試劑盒中的CD4 抗體，即BV480 標(biāo)記CD4 抗體，BUV395 標(biāo)記CD4 抗體，PERCPCY5.5 標(biāo)記CD4 抗體，PECY7 標(biāo)記CD4抗體，BV711 標(biāo)記CD4 抗體，BB515 標(biāo)記CD4 抗體，APC-R700 標(biāo)記CD4 抗體，AF647 標(biāo)記CD4 抗體，BV786CD4 抗體和染色緩沖液，均采用推薦用量，室溫避光孵育，溶血素，離心洗滌同上，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl。

1.4 儀器校準(zhǔn) 儀器保持維護(hù)良好狀態(tài)下運行CST質(zhì)控追蹤程序，校準(zhǔn)儀器基本參數(shù)穩(wěn)定。

1.5 儀器最佳檢測器電壓確定 逐個分析各色標(biāo)記CD4 單陽樣品，目標(biāo)檢測器參數(shù)從300 開始，每次遞增30，直到600 或者檢測信號接近檢測器上限停止，讀取各樣品陰性、陽性群體熒光中位數(shù)值，計算各檢測通道的信噪比，以信噪比最高的檢測器電壓值做為本通道最佳檢測電壓。

1.6 根據(jù)染色樣品確定最佳實驗檢測電壓 在初步檢測參數(shù)下運行9 色樣品，檢查各通道信號強弱是否適合，對于熒光強度超出檢測范圍的通道要下調(diào)檢測電壓保證信號位于檢測器的線性采集窗口內(nèi)，調(diào)整后確定為最佳檢測參數(shù)，完成九色樣品采樣。

1.7 CD4 單陽計算補償參數(shù) 建立儀器自動補償程序，分別獲取陰性對照樣品和九個CD4 單標(biāo)樣品，準(zhǔn)確選取淋巴細(xì)胞群和各CD4 單陽群，運行補償計算程序，計算并保存補償參數(shù)。

1.8 九色單陽對照驗證補償參數(shù) 將補償參數(shù)賦值給之前獲取的9 色樣品數(shù)據(jù)，在新補償參數(shù)下采集9例檢測抗體標(biāo)記單陽樣品，驗證補償條件無誤，確定補償參數(shù)。

2 結(jié)果

檢測顯示，補償前群體模糊不清，無法確定檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量，使用確定好的補償參數(shù)對9 色樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行熒光補償，補償后見圖1，其中藍(lán)色門圈選CD4+CD45RA-輔助T 淋巴細(xì)胞的效應(yīng)群體，對比補償前后圖可見細(xì)胞群體的位移。此方法獲取的9色標(biāo)記數(shù)據(jù)，各通道熒光溢漏擴(kuò)散均較理想，陰性、陽性群體區(qū)分明顯，各細(xì)胞群體指標(biāo)顯示清晰，可完成無重復(fù)采集的多色樣品分析。

圖1 CD4 單陽參考品輔助檢測九色標(biāo)記人血樣品

圖1 （續(xù)）

3 討論

多參數(shù)流式檢測具有參數(shù)多、速度快、影響因素多、分析難度大、數(shù)據(jù)質(zhì)量要求高等特點[3]，在流式實驗中是檢測難度最高的一類。通常在多色流式檢測時，需要實驗人員在采樣的短暫過程中，憑借經(jīng)驗對多個參數(shù)完成人為設(shè)置。本實驗中，可以看到在檢測過程中，即使是在最優(yōu)的檢測參數(shù)下，操作者也只能觀察到未經(jīng)補償?shù)碾s亂群體，既無法判斷分群情況，更無法估計熒光溢漏擴(kuò)散的情況。因此，通常是手動調(diào)節(jié)參數(shù)后采集少量樣品，運行補償程序，采集單陽對照，計算補償后代入預(yù)試，根據(jù)補償后群體分布情況調(diào)整電壓，往往需要反復(fù)調(diào)整多次，才能使數(shù)據(jù)較為理想，但是既浪費樣品，又耗費時間，并且由于主觀分析的隨意性和調(diào)整時間的局限，往往不能達(dá)到最佳的檢測參數(shù)。對于流式多色檢測，指標(biāo)眾多，群體數(shù)量巨大，檢測中要求盡可能清楚區(qū)分所有的群體，就必須注重溢漏擴(kuò)散的干擾。溢漏擴(kuò)散主要來自于檢測器的干擾信號，只有使用信噪比盡可能高的檢測參數(shù)才能得到更小的溢漏擴(kuò)散，才能最大限度的將陽性和弱陽性群體從背景中分離出來[4，5]。本方法利用了流式儀器通道的性能特點，利用BD 公司的CD4 抗體參考品試劑盒，預(yù)先利用光譜匹配，陽性明確的單色樣品，分析確定各不同檢測參數(shù)下檢測通道的性能表現(xiàn)，選取各通道的最佳檢測參數(shù)，在實際檢測中以最優(yōu)參數(shù)為參考，僅需要對少數(shù)超出界限的通道進(jìn)行微調(diào)，降低檢測參數(shù)至檢測器線性范圍上限即可，大大地減少了多色分析中實驗人員的主觀分析步驟，不需要反復(fù)多次上樣，節(jié)約樣品，可有效提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

本研究采用的參考樣品為人血細(xì)胞抗CD4 單陽性標(biāo)記樣品，在人免疫細(xì)胞表面分布的蛋白標(biāo)志物中，CD4 分子數(shù)量中等，是良好的陽性參考，可以代表一般的檢測指標(biāo)狀態(tài)，并且是實驗室常用抗體，容易獲得。本次使用的組合參考品試劑盒中CD4 抗體為同一克隆，且抗體均經(jīng)過滴定，反應(yīng)條件一致，由CD4 單陽標(biāo)品檢測得到的檢測通道信噪比最佳檢測電壓是檢測器的物理參數(shù)[6]，每臺儀器都有固定的數(shù)值，理論上適合所有指標(biāo)的檢測，可以作為多色分析的初設(shè)參數(shù)，但一些極高表達(dá)指標(biāo)有可能產(chǎn)生超出檢測器線性范圍的熒光信號，這時信號無法準(zhǔn)確補償，因此檢測中需要確保檢測信號線性度，只需要在上樣過程中根據(jù)樣品信號的實際情況，快速將超限通道的電壓降低，使信號進(jìn)入檢測器線性范圍，微調(diào)之后的檢測電壓即是適合本實驗指標(biāo)的最佳檢測參數(shù)。對于低表達(dá)指標(biāo)一般不需要調(diào)高檢測器電壓，因為反而會使信噪比下降，降低通道的分辨力[7]。在上述樣中僅需對少數(shù)超限通道調(diào)低電壓即可，不需要反復(fù)上樣，節(jié)省了樣品細(xì)胞和時間。

使用優(yōu)化后的參數(shù)完成采樣后樣品數(shù)據(jù)仍無法直接分析，由于流式儀器通道之間的熒光滲漏，各通道的信號互相混雜無法準(zhǔn)確辨認(rèn)，需要準(zhǔn)確的計算補償[8，9]。熒光補償是對不同通道之間熒光滲漏的調(diào)整操作，目的是盡可能將通道中的漏光排除，保證各通道信號的特異性，在多色分析中對于一個數(shù)據(jù)給予不同的補償參數(shù)可能會得到完全不同的分析結(jié)果，因此補償數(shù)據(jù)也很關(guān)鍵[9]。一般流式檢測常用單陽樣品，確定各通道的漏光與檢測信號熒光的比例進(jìn)行補償，但是在多參數(shù)流式實驗中通常會包括一些表達(dá)量低或者陽性比例低的指標(biāo)，如CD127、CD25、CD197，這些指標(biāo)的檢測通道和漏光通道上的信號較弱，不容易獲得滿意的補償數(shù)據(jù)，因此往往使用較強的單陽樣品代替（如補償微球）。本研究使用相同熒光素標(biāo)記的CD4 單陽代替，雖然抗體標(biāo)記蛋白不同，但是熒光素相同（同一廠家），光譜穩(wěn)定，可以替代使用。同時，由于各色的CD4 標(biāo)記細(xì)胞為相同群體，補償時的細(xì)胞熒光本底更為一致，結(jié)果與使用補償微球計算的結(jié)果近似，且檢測信號分布在線性范圍之內(nèi)，避免了微球補償時陽性群體信號超出檢測器線性范圍的情況[10，11]。為了使計算的補償參數(shù)更加匹配檢測樣品的實際情況，本次使用檢測抗體標(biāo)記的單陽樣品代入補償值驗證，對有明顯偏差的通道可手工微調(diào)，使補償與各單陽樣品標(biāo)記吻合，再將修正的補償應(yīng)用到多色數(shù)據(jù)上，即可獲得清晰的補償后數(shù)據(jù)。

本實驗采用優(yōu)化的檢測參數(shù)一次完成9 色樣品的分析與補償，分析結(jié)果群體區(qū)分清晰，避免了傳統(tǒng)主觀調(diào)試的反復(fù)上樣調(diào)整，節(jié)省了細(xì)胞樣品，可以保證檢測通道達(dá)到理想的信噪比和分辨力，同時簡便可靠的計算補償，提高多色數(shù)據(jù)質(zhì)量，方便操作者快速準(zhǔn)確的完成多參數(shù)流式的檢測。

綜上所述，通過對相同光譜的一系列CD4 標(biāo)記單陽參考樣品以遞增檢測參數(shù)重復(fù)分析，獲得各通道檢測器性能數(shù)據(jù)，依據(jù)流式細(xì)胞儀的檢測器性能特點，簡便快速的確定各通道最佳檢測參數(shù)，避免操作者主觀判斷失誤，結(jié)合自動補償和補償驗證步驟，確保準(zhǔn)確合理的補償，提高流式多色數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量，使流式分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、客觀，同時節(jié)省細(xì)胞樣品。