右美托咪定對老年結(jié)直腸癌患者術(shù)后認(rèn)知功能及血漿miR- 206、BDNF水平的影響

陳小剛，汪正偉

(重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院 麻醉科，重慶 401147)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)被認(rèn)為與全身性炎癥、神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)受損有關(guān)，在行結(jié)直腸癌手術(shù)的老年患者中發(fā)生率較高[1]。腦源性神經(jīng)生長因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)元發(fā)育和記憶加工的關(guān)鍵因子，Wang等[2]在POCD大鼠海馬中觀察到給予右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)后緩解了大鼠相關(guān)的認(rèn)知功能障礙和炎癥改變，并上調(diào)腦組織BDNF的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮一定的神經(jīng)元保護(hù)作用。目前有研究發(fā)現(xiàn)miR- 206與BDNF的表達(dá)相關(guān)[3- 4]，但是尚缺乏臨床數(shù)據(jù)支持。本實驗擬研究DEX對老年結(jié)直腸癌患者術(shù)后認(rèn)知功能及血漿微小RNA- 206(microRNA- 206,miR- 206)、BDNF水平的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 一般資料 招募2018年1月至2019年12月期間在我院計劃行全身麻醉腹腔鏡下結(jié)直腸癌根治性切除術(shù)、年齡60～80歲的患者160例，按照隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為研究組和對照組兩組各80例。研究組男51例，女29例，年齡60～80歲，平均(68.64±6.37)歲，病程(0.71±0.26)年；對照組男44例，女36例，年齡60～80歲，平均(69.31±6.58)歲，病程(0.68±0.21)年。兩組年齡、性別、病程具有可比性(P>0.05)。本研究屬于前瞻性、隨機(jī)、對照研究，已經(jīng)獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者均簽署知情同意書后方可入組。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1) 年齡>60歲；(2) 美國麻醉醫(yī)師協(xié)會(American Society of Anesthesiologists，ASA)病情分級Ⅰ～Ⅲ級；(3) 術(shù)前簡易智力狀態(tài)檢查量表(mini- mental state examination，MMSE)評分≥23分；(4) 無溝通障礙。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1) 合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、心血管或呼吸系統(tǒng)疾病、肝腎功能障礙等；(2) 長期服用鎮(zhèn)靜劑、阿片類藥物、鎮(zhèn)痛藥或抗抑郁藥物者；(3) 有酗酒、吸煙或藥物依賴史；(4) 麻醉前心動過緩(心率<60次·min-1)；(5) 對試驗中所用藥物過敏或有禁忌證。

1.2 手術(shù)麻醉處理及患者生命體征監(jiān)測

為了消除手術(shù)技巧的可能影響，所有手術(shù)都由同一個手術(shù)組完成。所有手術(shù)均在全麻下進(jìn)行。為保持雙盲原則，麻醉準(zhǔn)備和施行麻醉的麻醉醫(yī)師在緊急情況發(fā)生前不參與管理或評估。患者術(shù)前常規(guī)禁飲禁食和行其他術(shù)前準(zhǔn)備，根據(jù)疾病的位置、程度和分期進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的腹腔鏡手術(shù)。用0.04 mg·kg-1咪達(dá)唑侖[規(guī)格為1 ml·(5 mg)-1，生產(chǎn)批號20171210，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)]、0.5 μg·kg-1舒芬太尼[規(guī)格為2 ml·(100 μg)-1，生產(chǎn)批號81A07207，宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)]、0.3 mg·kg-1依托咪酯[規(guī)格為10 ml·(20 mg)-1，生產(chǎn)批號20180102，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)]和0.6 mg·kg-1羅庫溴銨[規(guī)格為2.5 ml·(25 mg)-1，生產(chǎn)批號20180215A，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)]誘導(dǎo)麻醉。瑞芬太尼(規(guī)格為每針按C20H28N2O5計1 mg，生產(chǎn)批號80A07251，宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn))0.2～0.3 g·(kg·min)-1和丙泊酚[規(guī)格為10 ml·(0.1 g)-1，生產(chǎn)批號20180201，四川國瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)]0.1～0.15 mg·(kg·min)-1維持麻醉，必要時采用順式阿曲庫銨(規(guī)格為每針10 mg，生產(chǎn)批號181119AK，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn))肌肉松弛。研究組患者麻醉前10 min給予DEX[規(guī)格為2 ml·(200 μg)-1，生產(chǎn)批號171021BP，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)]1 mg·kg-1，術(shù)中給予DEX 0.3 mg·(kg·min)-1(10 min后由醫(yī)生決定調(diào)整每例患者的輸液速度)至手術(shù)結(jié)束前30 min。對照組患者術(shù)中給予等量生理鹽水代替DEX。兩組患者術(shù)中予心電圖(ECG)、無創(chuàng)血壓、心率脈搏血氧飽和度(SpO2)監(jiān)測。前額放置Narcotrend麻醉深度監(jiān)測儀(Narcotrend- Compact，德國漢諾威醫(yī)科大學(xué)生產(chǎn))，以記錄手術(shù)期間的Narcotrend值。麻醉指數(shù)保持在D1～E之間。術(shù)中靜脈輸注乳酸鈉林格注射液(規(guī)格為每瓶500 ml，生產(chǎn)批號D17100404- 1，四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))和羥乙基淀粉(每500 ml含30 g羥乙基淀粉，生產(chǎn)批號81M1642，北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，間歇性動脈血中含氧量分析，血紅蛋白<100 g·L-1或血細(xì)胞比容<0.3時輸注紅細(xì)胞懸液或冷凍鮮血漿。

1.3 觀察內(nèi)容和指標(biāo)檢測

1.3.1 基線資料 收集所有患者基線資料，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、血壓、ASA病情分級等。

1.3.2 血漿miR- 206水平檢測 術(shù)前及術(shù)后1、3、7 d使用抗凝采血管采取清晨空腹外周靜脈血5 ml，3 500 r·min-1離心10 min，獲取血漿于-80 ℃保存待測。采用miRNeasy RNA分離試劑盒(Qiagen公司)按說明書提取血漿總miRNA。通過納米滴吸收光度法檢測RNA質(zhì)量，僅將A260/280>2.0的RNA片段用于后續(xù)反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄使用miScript Ⅱ RT試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行。此外，使用預(yù)先設(shè)計的針對靶向miR- 206的混合引物和Qiagen miScript PreAMP PCR試劑盒進(jìn)行12個周期的預(yù)擴(kuò)增，選擇小分子U6作為內(nèi)源性參考基因。在7900 HT 快速實時PCR系統(tǒng)(美國Thermo Fisher scientific公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用Qiagen miScript SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCT公式對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用參考基因U6 mRNA對目標(biāo)特異性擴(kuò)增效率結(jié)果進(jìn)行歸一化處理。每個樣本平均實驗3次。miR- 206引物序列：正向5′- CCGAGGCCACATGCTTCTTTA- 3′，反向5′- TTGCCGAAACCACACACTTC- 3′；U6 mRNA引物序列：正向5′- CGCTTCGGCAGCACATATAC- 3′，反向5′- CAGGGCCATGCTAATCTT- 3′。

1.3.3 血漿BDNF水平檢測 在術(shù)前和術(shù)后1、3、7 d時，使用EDTA抗凝管各采取清晨空腹外周靜脈血2 ml，3 500 r·min-1離心10 min，獲取血漿于-80 ℃保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，應(yīng)用BDNF ELISA試劑盒(美國R&D公司)測定BDNF水平；所有血漿樣本用人BDNF免疫分析法進(jìn)行雙重分析，每個微量滴定板連續(xù)測定一個內(nèi)部對照樣本。樣本的分析間變異系數(shù)為11.2%，分析內(nèi)變異系數(shù)為6.3%。

1.3.4 術(shù)后認(rèn)知功能測試 神經(jīng)心理測試由實驗前已經(jīng)接受專業(yè)培訓(xùn)的研究人員進(jìn)行。大部分測試都由同一個核心小組的研究人員完成。在術(shù)前及術(shù)后3、7 d 時采用MMSE評價認(rèn)知功能，內(nèi)容包括時間定向力、地點定向力、即刻記憶、注意力及計算力、延遲記憶、語言、視空間。根據(jù)Rasmussen等[5]的建議，用術(shù)后評分減去術(shù)前評分計算可靠性變化指數(shù)(reliable change index，RCI)，當(dāng)RCI至少在2次測驗中<-1.96 時定義為POCD。

1.3.5 不良反應(yīng)發(fā)生情況 記錄手術(shù)開始至術(shù)后3 d出現(xiàn)的不良反應(yīng)，包括低血壓、心率加快、心動過緩、呼吸抑制、惡心嘔吐等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 對照組與研究組患者術(shù)前資料和術(shù)中情況比較

對照組與研究組患者年齡、性別、BMI、病程、飲酒史、ASA病情分級、術(shù)前MMSE評分、合并疾病史、Duke分期及術(shù)中代血漿用量、尿量、出血量、麻醉持續(xù)時間、手術(shù)時間等比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 對照組與研究組患者術(shù)前資料和術(shù)中情況比較

2.2 對照組與研究組患者手術(shù)結(jié)局比較

研究組患者術(shù)后3 d和7 d時POCD的發(fā)生率低于對照組(P<0.05)，住院時間短于對照組(P<0.001)；研究組患者睜眼時間和拔管時間長于對照組(P<0.05和P=0.001)；兩組患者術(shù)后不良反應(yīng)發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 對照組與研究組患者手術(shù)結(jié)局比較

2.3 對照組與研究組患者手術(shù)前后血漿BDNF水平比較

重復(fù)測量設(shè)計的方差分析顯示：(1) 患者不同時間點的血漿BDNF水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=268.228，P<0.001)；(2) 對照組與研究組患者血漿BDNF水平比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=58.868，P<0.001)；(3) 對照組與研究組患者血漿BDNF水平變化趨勢比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.265，P<0.001)。另外Post- hoc分析顯示，術(shù)后1、3、7 d時，研究組患者血漿BDNF水平高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 對照組與研究組患者手術(shù)前后血漿BDNF水平比較

2.4 對照組與研究組患者手術(shù)前后血漿miR- 206相對表達(dá)量比較

重復(fù)測量設(shè)計的方差分析顯示：(1) 患者不同時間點的血漿miR- 206相對表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=118.079，P<0.001)；(2) 對照組與研究組患者血漿miR- 206相對表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=374.532，P<0.001)；(3) 對照組與研究組患者血漿miR- 206相對表達(dá)量變化趨勢差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=44.805，P<0.001)；另外術(shù)后1、3、7 d時，研究組患者血漿miR- 206相對表達(dá)量低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 對照組與研究組患者手術(shù)前后血漿miR- 206相對表達(dá)量比較

2.5 POCD組與非POCD組患者手術(shù)前后血漿BDNF水平和miR- 206相對表達(dá)量變化比較

根據(jù)術(shù)后7 d時是否發(fā)生POCD，將160例手術(shù)患者分為POCD組(n=21)與非POCD組(n=139)，比較兩組患者術(shù)前及術(shù)后1、3、7 d時的血漿BDNF水平和miR- 206相對表達(dá)量。重復(fù)測量設(shè)計的方差分析顯示：(1) 患者不同時間點的血漿BDNF水平和miR- 206相對表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(BDNF：F=225.860，P<0.001；miR- 206：F=1089.637，P<0.001)；(2) POCD組與非POCD組患者血漿BDNF水平及miR- 206相對表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(BDNF：F=837.256，P<0.001；miR- 206：F=1 793.458，P<0.001)；(3) POCD組與非POCD組患者血漿BDNF水平及miR- 206相對表達(dá)量變化趨勢差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(BDNF：F=165.430，P<0.001；miR- 206：F=572.819，P<0.001)。另外，與非POCD組相比，術(shù)后1、3、7 d時，POCD組患者血漿BDNF水平均較低，血漿miR- 206相對表達(dá)量均較高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表5。

表5 POCD組與非POCD組患者手術(shù)前后血漿BDNF水平及miR- 206相對表達(dá)量比較

2.6 ROC曲線分析術(shù)后1 d時miR- 206相對表達(dá)量對POCD發(fā)生的預(yù)測價值

術(shù)后1 d時miR- 206相對表達(dá)量對患者術(shù)后3、7 d POCD的發(fā)生均有一定的預(yù)測價值，AUC分別為0.78(95%CI為0.67～0.84，P<0.001)、0.82(95%CI為0.71～0.89，P<0.001)。最佳閾值分別為4.15和4.10，靈敏度分別為84.5%和94.32%，特異度分別為64.98%和62.17%。見圖1。

圖1 術(shù)后1 d時血漿miR- 206相對表達(dá)量預(yù)測術(shù)后3、7 d POCD發(fā)生的ROC曲線 A.預(yù)測術(shù)后3 d POCD發(fā)生的ROC曲線； B.預(yù)測術(shù)后7 d POCD發(fā)生的ROC曲線

2.7 多因素Logistic回歸分析影響POCD發(fā)生的危險因素

將術(shù)后7 d時POCD的發(fā)生作為因變量(POCD=1，非POCD=0)，將術(shù)前(年齡、性別、BMI、病程、飲酒史、ASA病情分級、術(shù)前MMSE評分、合并疾病史、Duke分期)、術(shù)中(代血漿用量、尿量、出血量、麻醉持續(xù)時間、手術(shù)時間)相關(guān)指標(biāo)及術(shù)后1 d血漿miR- 206相對表達(dá)量納入單因素Logistic回歸模型，結(jié)果顯示，術(shù)前MMSE評分、糖尿病史、DEX使用以及術(shù)后1 d時血漿miR- 206相對表達(dá)量與術(shù)后7 d時POCD的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)(P<0.05)；將上述變量納入多因素Logistic回歸方程，結(jié)果顯示，患者術(shù)后3 d和7 d時POCD發(fā)生的危險因素為有糖尿病病史、DEX使用以及術(shù)后1 d時血漿miR- 206相對表達(dá)量>4.10(P<0.05)。見表6。

表6 術(shù)后7 d時POCD發(fā)生的Logistic回歸分析

3 討 論

目前共識認(rèn)為老年人群POCD的發(fā)生率比60歲以下人群更高，而且POCD多與患者術(shù)后恢復(fù)不良、住院時間延長、住院費用和長期康復(fù)需求較高以及死亡風(fēng)險大有關(guān)[6- 8]。本研究中，術(shù)前10 min和術(shù)中給予DEX可降低老年(≥60歲)結(jié)直腸癌患者在腹腔鏡下根治手術(shù)后3 d和7 d內(nèi)認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率。這與既往眾多研究[9- 10]結(jié)論一致，作者推測這可能與DEX具有抗炎及改善術(shù)后疼痛作用有關(guān)。DEX是一種高效、高選擇性的跨膜G蛋白偶聯(lián)中樞α2受體激動劑，可減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)交感神經(jīng)流出，除降低血壓和心率外，還可提供鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，而不會引起呼吸抑制[11]。除此以外，DEX的阿片類作用是眾所周知的。這些特性使其成為重癥監(jiān)護(hù)病房和圍手術(shù)期患者鎮(zhèn)靜的合適選擇。但本研究由于納入的樣本量偏少，研究組與對照組老年患者術(shù)后低血壓、心率過緩、心動過速、呼吸抑制等不良反應(yīng)發(fā)生率的差異未顯示統(tǒng)計學(xué)意義。此外有體外研究認(rèn)為，長期使用DEX可活化PI3K/AKT信號通路，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移等[12]，但是這一點尚沒有臨床證據(jù)支持。而且作為麻醉用藥，DEX短時間內(nèi)即可代謝，因此其對腫瘤細(xì)胞的影響幾乎可以忽略不計。

POCD是一個多因素的疾病模型，雖其發(fā)病機(jī)制并不清晰，但臨床普遍認(rèn)為其是神經(jīng)系統(tǒng)老化、麻醉、手術(shù)及術(shù)前病史等多種因素共同誘發(fā)的[13]。此外，很多基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，BDNF在POCD發(fā)生過程中可能涉及沉默信息調(diào)節(jié)因子1信號通路的激活、NF- κB信號通路的抑制等[14- 15]。本研究也發(fā)現(xiàn)POCD患者血漿BDNF濃度在術(shù)后7 d內(nèi)的變化與非POCD患者間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而且在術(shù)后1、3、7 d時，POCD組患者血漿BDNF水平均顯著低于非POCD組患者，說明麻醉及手術(shù)過程誘導(dǎo)BDNF濃度增加可能是導(dǎo)致POCD發(fā)生的重要機(jī)制。BDNF是一類保護(hù)性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，廣泛分布于中樞神經(jīng)、周圍神經(jīng)及內(nèi)分泌等系統(tǒng)，具有維持神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、促神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)等作用。Lü等[16]通過使用新生大鼠的海馬神經(jīng)元細(xì)胞為模型，得出DEX可以通過上調(diào)BDNF的表達(dá)及N- 甲基- D- 天門冬胺酸受體磷酸化水平來實現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用的結(jié)論。同時Dong等[17]認(rèn)為，DEX也可以通過減輕麻醉藥物對BDNF的抑制作用進(jìn)而提高BDNF水平。這些基礎(chǔ)研究結(jié)論都很好地解釋了本研究結(jié)果。但是需要強(qiáng)調(diào)的是，血漿中BDNF水平受到血腦屏障的影響較大，因此并不能完全反映其腦內(nèi)水平；而且不同手術(shù)類型可能造成的血腦屏障損害不同，這將干擾血漿BDNF水平作為POCD外周血循環(huán)標(biāo)志物的敏感性。但是與BDNF蛋白表達(dá)相關(guān)的miRNAs則不易受到血腦屏障的影響，而且在神經(jīng)元損傷早期即可表現(xiàn)出變化，因此在本研究中，我們期望尋找比BDNF更敏感的miRNAs用于POCD的臨床預(yù)測以及對POCD發(fā)生風(fēng)險的評估。

BDNF轉(zhuǎn)錄本包含短非編碼區(qū)(BDNF- sh，350nt)和長非編碼區(qū)(BDNF- l，2891nt)。Xing等[18]證實，miR- 206對BDNF基因轉(zhuǎn)錄后翻譯有一定的抑制作用。除了長度，3′UTR的二級結(jié)構(gòu)也影響B(tài)DNF mRNA的穩(wěn)定性，其中部分是通過修改轉(zhuǎn)錄本中miRNAs靶點的可接近性。BDNF- l包含了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性所必需的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這提高了二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此到目前為止，只發(fā)現(xiàn)少數(shù)miRNAs可與BDNF mRNA結(jié)合，并參與BDNF水平的生理和病理性調(diào)節(jié)，其中就包括miR- 206。在本實驗中，我們首次通過臨床研究證實，術(shù)后1 d血漿miR- 206相對表達(dá)量變化對POCD有一定的預(yù)測價值。在這里需要強(qiáng)調(diào)的是，腫瘤本身對血漿miR- 206水平也有一定的影響，但是術(shù)前POCD組和非POCD組患者血漿miR- 206水平無顯著差異，而我們考察的是術(shù)后1 d時血漿miR- 206水平對POCD發(fā)生的影響，因此術(shù)后殘余腫瘤對血漿miR- 206水平的影響幾乎可以忽略。并且我們通過多因素Logistic回歸分析，盡可能校正多種術(shù)前和手術(shù)過程中混雜因素后得出，術(shù)后1 d血漿miR- 206相對表達(dá)量依然是老年結(jié)直腸癌患者POCD發(fā)生的獨立危險因素。

綜上所述，對于接受全麻手術(shù)的老年結(jié)直腸癌患者，POCD的發(fā)生可能與術(shù)后血漿miR- 206相對表達(dá)量升高及BDNF水平降低有關(guān)，尤其是血漿miR- 206相對表達(dá)量升高是POCD發(fā)生的獨立危險因素。而給予DEX，則可以明顯提高患者術(shù)后7 d內(nèi)血漿BDNF水平，降低血漿miR- 206相對表達(dá)量，這可能是降低POCD發(fā)生風(fēng)險的分子機(jī)制之一。本研究從分子機(jī)制角度進(jìn)一步證實了DEX對手術(shù)和麻醉引起的神經(jīng)組織損傷有一定的保護(hù)作用，從而可為DEX的臨床應(yīng)用提供更可靠的實驗證據(jù)支持。

聲明：本文所有作者間不存在利益沖突。