基于網(wǎng)絡藥理學探討人參-甘松藥對治療陣發(fā)性房顫的作用機制

郭經(jīng)奇，李 瑩，范吉林，任雯慶，薛振宇，張世亮

（1.山東中醫(yī)藥大學，2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014）

陣發(fā)性房顫（PAF）是我國常見心律失常的一種，發(fā)病時心房顫動，心室出現(xiàn)不規(guī)則快速的收縮，有時伴有胸悶、憋氣、心慌等癥狀，嚴重者可出現(xiàn)休克導致死亡，必須給予有效的治療和預防［1，2］。目前臨床上該病治療以西藥為主，雖然西藥取得了一定的療效，但仍會導致其他心律失常，副作用明顯。大量臨床實驗和經(jīng)驗證明，中醫(yī)中藥不僅治療PAF效果較好，還能改善西藥帶來的不良反應。再者，隨著大眾對中醫(yī)中藥認知度、認可度的增高，中醫(yī)藥的應用顯得尤為重要。

人參、甘松是張世亮教授臨床上治療陣發(fā)性房顫的常用藥對，長期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)該藥對的應用不但能明顯降低房顫發(fā)作次數(shù)和每次發(fā)作的時間，而且對心、腦、腎等器官的保護也有效果。人參藥用部位是根與根莖，中醫(yī)認為其能補五臟，安魂魄，貴為藥中之上品，大補元氣，氣足則血充，氣血充足則脈搏調和，甘松藥用部位也是干燥根與根莖，辛香行散，入肝脾心經(jīng)，能理氣止痛，醒脾健胃，止驚悸安神［3］，人參、甘松合用既能補氣行氣，又能安神止驚。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，人參中有40 多種皂苷，在神經(jīng)、心血管、內分泌疾病中具有積極作用，人參皂苷Rg1 具有抗炎抗氧化作用，而且能減輕大鼠心肌損傷后心律失常的發(fā)生率［4，5］，甘松具有抗心律失常、抗抑郁、提高心肌耐受缺氧能力等作用［6］?，F(xiàn)中醫(yī)學者多把甘松作為君藥或臣藥來治療PAF。其中參松養(yǎng)心膠囊就配伍人參甘松來治療心律失常。目前研究更多的是關注單個藥物和單種成分的作用，而臨床證明中藥復方在緩解PAF 癥狀，調節(jié)心律，提高生活質量上取得很好療效［7］。而人參-甘松藥對治療陣發(fā)性房顫的作用機制尚不明確，其系統(tǒng)性研究少有報道，本研究基于網(wǎng)絡藥理學，系統(tǒng)分析該藥對的有效活性成分和作用靶點，利用數(shù)據(jù)庫分析核心蛋白并通過GO 和KEGG 分析主要功能和主要途徑，為指導臨床和今后的深入研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物潛在有效成分的獲取

登錄中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫（TCMSP http：//lsp.nwu.edu.cn/），分別以人參和甘松為關鍵詞進行檢索，獲得人參和甘松所有的化學成分，包括化學成分的名字（moleclue name）、生物利用度（OB）、類藥性（DL）等。眾所周知，藥物不是所有的化學成分都能發(fā)揮治療作用，OB 包括生物利用程度和生物利用速度，程度是指中藥經(jīng)口服進入機體吸收入血后，經(jīng)過肝臟首過效應進入血液循環(huán)的藥量百分比，速度則指藥物進入血液循環(huán)達到有效劑量的時間。OB 是決定藥物的化學成分是否具備有效活性的關鍵指標。DL 是指化學成分與已知藥物的相似度，可體現(xiàn)此化學成分成為藥物的可能性。結合文獻研究，將OB≥30%，DL≥0.18 為條件，篩選出人參和甘松的潛在有效成分。

1.2 藥物潛在靶點的獲取

繼續(xù)通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索人參和甘松的所有成分的靶點，并與已得到的潛在成分相映射，獲得潛在靶點，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）將人參和甘松有效靶點與人類相關基因相對應，獲得藥物的潛在靶點。

1.3 陣發(fā)性房顫靶點的獲取

登 錄GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.genecards.org/），以paroxysmal atrial fibrillation 為關鍵詞進行檢索，獲得陣發(fā)性房顫的所有相關靶基因，并導出到Excel，為后續(xù)處理做準備。

1.4 藥物疾病靶點韋恩圖的繪制

為了觀察人參-甘松藥對與陣發(fā)性房顫的關聯(lián)，利用繪圖網(wǎng)址（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），將已獲得的藥物潛在靶點和疾病靶點導入，從而獲得韋恩圖。通過韋恩圖可以更加直觀的看出，人參-甘松藥對是通過多基因、多靶點來治療陣發(fā)性房顫。

1.5 藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡構建

將藥物疾病映射的共同靶點與藥物的有效活性成分導入Cytoscape3.7.2 軟件，構建藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.6 核心靶標PPI 網(wǎng)絡構建

為了進一步獲取關鍵靶點，利用STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），將藥對和疾病的共同靶點導入該數(shù)據(jù)庫，并限定物種為人類物種（Homo sapiens），獲得蛋白互作網(wǎng)絡圖（PPI），檢索研究相關文獻，為確保可信度，將交互分數(shù)限定為＞0.4，去除無相互作用的單一蛋白，獲得最終的PPI 網(wǎng)絡圖，導出圖片并以TSV 格式保存結果，利用R x64 3.6.2軟件，將結果挑選出前30 名核心靶標，并繪制柱狀圖。

1.7 GO 分 析 與KEGG 通 路 分 析

為了分析人參-甘松藥對作用于陣發(fā)性房顫的生物功能過程和通路傳導過程，從而更清晰的闡述作用機制，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（http：//david.ncifcrf.gov/）對篩選出的藥物和疾病的共同靶點基因進行GO 分析和KEGG 分析。

2 結果

2.1 潛在有效成分篩選結果

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集到，人參190 個化學成分，甘松57 個化學成分，共247 個化學成分。以OB≥30%，DL≥0.18 作為條件，篩選得到潛在的有效成分，人參22 個潛在成分，甘松6 個潛在成分，共獲得28 個潛在有效成分，如豆甾醇、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2、金合歡素、隱丹參酮、刺槐堿等，見表1。

表1 人參-甘松藥對潛在有效成分Tab 1 Potentially active components of Renshen-Gansong drug pairs

2.2 藥物疾病靶基因結果與韋恩圖的繪制

在獲得的人參甘松28 個潛在有效成分中，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫共找到人類相關靶點97 個，通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫共找到陣發(fā)性房顫靶點750 個，利用繪圖網(wǎng)址，得到藥物與疾病的共同靶點45 個，并繪制出韋恩圖，見圖1。

圖1 藥物疾病靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of drug disease target

2.3 藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡構建

將有效成分與共同靶點導入Cytoscape3.7.2 軟件獲得可視化的調控網(wǎng)絡圖，見圖2。圖中節(jié)點包括藥物、疾病、活性成分、靶點，而邊則表示他們之間存在相互關系，紅色菱形代表疾病和藥物，綠色圓形代表人參活性成分，藍色圓形代表甘松活性成分，黃色三角形代表靶點基因，通過此網(wǎng)絡直觀的看出人參-甘松藥對治療陣發(fā)性房顫是通過多種成分、多種靶點來發(fā)揮作用。

圖2 藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖Fig 2 Drug-disease-active components-target network diagram

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡圖與核心靶標柱狀圖

利用STRING 數(shù)據(jù)庫獲得蛋白互作網(wǎng)絡圖，見圖3，圖中共有50 個節(jié)點，310 條邊，節(jié)點代表蛋白，淺藍色邊代表來自管理的數(shù)據(jù)庫（from curated databases），紫色邊代表實驗測定（experimentally determined），綠色邊代表基因相鄰（gene neighborhood），紅色邊代表基因融合（gene fusions），深藍色邊代表基因共現(xiàn)（gene co-occurrence），黃色邊代表文本挖掘（textmining），黑色邊代表共表達（co-expression），淡藍色邊代表蛋白質同源性（protein homology）。利用R 軟件挑選出前30 位核心靶標并繪制柱狀圖，見圖4，如P53 蛋白、前列腺素內過氧化物合酶2、腫瘤壞死因子、白細胞介素-1β、JUN 蛋白、絲裂原激活蛋白激酶14、內皮一氧化氮合成酶、雌激素受體1、血紅素加氧酶1 等，提示這些靶標可能為人參甘松治療陣發(fā)性房顫的關鍵核心成分。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡圖Fig 3 Protein interaction network diagram

圖4 核心靶標柱狀圖Fig 4 Histogram of core targets

2.5 GO 分 析 與KEGG 通 路 分 析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫將篩選出的疾病和藥物共同靶點進行GO 分析，為了數(shù)據(jù)更準確，設置pvalueCutoff 為0.05，共得到了80 條GO 生物功能，選取前20 的主要功能繪制氣泡圖，見圖5。參與的功能主要有神經(jīng)遞質受體活性（Neurotransmitter receptor activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）、被動跨膜轉運蛋白活性（passive transmembrane transporter activity）門控通道活動（gated channel activity）、離子通道活性（ion channel activity）的調節(jié)，血紅素結合（heme binding）、四吡咯結合（tetrapyrrole binding）、泛素蛋白連接酶結合（ubiquitin protein ligase binding）等。繼續(xù)進行KEGG 通路富集分析，共獲得114 條通路，選取前20 條繪制柱狀圖，見圖6，參與的通路包括信號通路，如IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、VEGF 信 號 通 路（VEGF signaling pathway）等，其他通路如流體剪應力與動脈粥樣硬化通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、5-羥色胺能突觸通路（Serotonergic synapse）、心肌細胞中的腎上腺素能信號轉導通路（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）等，結果顯示人參-甘松藥對治療陣發(fā)性房顫與多種生物功能、多種通路密切相關。

圖5 前20 生物功能氣泡圖Fig 5 Top 20 biological function bubble chart

圖6 前20 通路柱狀圖Fig 6 Histogram of the top 20 channels

3 討論

陣發(fā)性房顫目前是我國常見心律失常之一，人口老齡化的加重，導致其患病率增加。小于60 歲人群患病率約1%，75～84 歲患病率約12%，大于80歲患病率超過1/3［8］。如此高的患病率，不僅給家庭帶來較大的生活壓力，也給社會帶來經(jīng)濟負擔［9］。陣發(fā)性房顫在祖國醫(yī)學中稱為“心悸”、“怔忡”，其基本病機主要是臟腑氣血虛衰失調，人參補氣之力甚佳，氣充則血充，又能安五臟，恰中病機。甘松能行氣解郁開竅，入心經(jīng)，能安心神、定心悸、養(yǎng)心血，入脾經(jīng)，能理氣，調節(jié)氣機升降，使補而不滯。人參、甘松合用，具有補心止悸之效。

本研究基于現(xiàn)代藥理研究與網(wǎng)絡藥理學平臺探討人參-甘松藥對治療陣發(fā)性房顫的作用機制，共收集到28 種有效成分。如豆甾醇（Stigmasterol）屬于植物甾醇，具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、抗糖尿 病 的 作 用［10］。張 浩 楠 等［11］通 過 豚 鼠 實 驗 證 明，β-谷甾醇（beta-sitosterol）和山奈酚（kaempferol）具有抗心律失常的作用。山奈酚具有抗炎，抗氧化，調節(jié)免疫，保護心肌等作用［12］。甘春麗等［13］研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚黃酮醇類化合物能選擇性阻斷L 型鈣通道，拮抗鈣超載，保護心肌細胞。研究表明金合歡素（acaciin）能抗炎抗氧化，抗癌，調節(jié)免疫，保護心臟 等 作 用［14］。Wu 等［15］通 過 研 究HEK293 細 胞 發(fā)現(xiàn)，金合歡素能抑制hKv4.3 電流并降低失活后的恢復，通過對hKv4.3 的使用和阻斷可能對房顫的治療有作用。隱丹參酮（cryptotanshinone）能抗心血管疾病，改善微循環(huán)，改善心肌供血，抗炎抗氧化［16］。綜合看來，人參-甘松可能通過抗炎抗氧化，調節(jié)hKv4.3 等過程治療陣發(fā)性房顫。

藥物-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖的構建，可直觀感受到人參-甘松藥對治療陣發(fā)性房顫是通過多成分，多靶點發(fā)揮作用。PPI 網(wǎng)絡圖顯示各蛋白靶點之間關系密切，相互作用最多的前4 位蛋白靶點為P53 蛋白（TP53）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-1β（IL1B）。研究表明，P53 基因雖是重要的抑癌基因，但其在各種細胞中廣泛存在，并與心血管疾病密切相關，能抑制細胞凋亡，抗動脈粥樣硬化，改善心肌缺血，相信隨著對P53 基因研究的不斷深入，能發(fā)現(xiàn)在心血管其他疾病中的重要作用［17］。郭麗娜等［18］通過研究發(fā)現(xiàn)，葛根通過多靶點多途徑治療心血管疾病，預測到可能與PTGS2 基因的表達有關，PTGS2 基因參與腫瘤、炎癥反應等多種病理生理過程。相關臨床研究顯示，炎癥在房顫的觸發(fā)和維持中發(fā)揮重要作用，TNF-α 作為炎癥因子通過改變離子通道，導致心房重構，增加房顫的發(fā)病率，且在房顫患者中，TNF-α 水平明顯增高［19-21］。Wang 等［22］通過對犬的實驗發(fā)現(xiàn)，IL-1β 能顯著激活心臟左側星狀神經(jīng)節(jié)這一重要交感神經(jīng)成分，從而發(fā)生室性心律失常。張倩倩等［23］也通過犬實驗發(fā)現(xiàn)，IL-1β 能顯著激活心房神經(jīng)節(jié)叢，誘導房顫的發(fā)生，并促進房顫患者心房纖維化。因此蛋白互作網(wǎng)絡也體現(xiàn)出作用機制是復雜多樣的。

GO 分析和KEGG 分析結果顯示，人參甘松治療陣發(fā)性房顫主要涉及炎癥因子信號通路，包含IL-17 信號通路、TNF 信號通路；信號傳導通路，包含糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、VEGF 信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號轉導通路；離子轉運相關通路，包含鈣信號通路等；疾病信號通路，包含利什曼病通路、非洲錐蟲病等。因此推斷，人參、甘松藥對治療陣發(fā)性房顫可能與這些信號通路密切相關。近研究顯示炎癥與炎癥因子與AF 的發(fā)生、維持關系緊密，桑翠［24］通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，Th17 細胞響應IL-23 刺激產(chǎn)生的IL-17能誘導和介導炎癥的發(fā)生，參與了永久性房顫的病理過程。成晨等［25］從選取的384 名孤立性房顫患者中發(fā)現(xiàn)了NPPA 突變基因p.Ile138Thr，為確定該突變基因能誘導房顫，進行了大鼠實驗，發(fā)現(xiàn)突變基因通過激活多個途徑，包括TNF 信號通路、NF-κB通路和nod 樣通路，TNF 通路和NF-κB 通路能激活IL-1β 基因，導致免疫反應和炎癥，最終導致房顫。鈣信號通路［26］能調控許多細胞的功能，張菀桐等［27］通過大鼠實驗，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心顆粒能調控Cav1.2-CaM-CaMKⅡ信號通路，減輕房顫大鼠心肌細胞鈣超載，恢復鈣穩(wěn)態(tài)，從而治療房顫。

綜上，本研究初步揭示了人參-甘松藥對通過多種靶點、多種成分、多種功能與信號通路協(xié)同發(fā)揮治療陣發(fā)性房顫的作用，除已報道的文獻，仍有部分研究結果需要進一步實驗證實，共同探討藥物的作用機制，為臨床提供理論依據(jù)。