基于TLR4/NF-κB 信號通路探究白茅根對社區(qū)獲得性肺炎患者的炎性因子及療效影響

李秋呈，李 琪，2，3，賈盼紅，李少寧，熊曉嫚，周向東，2，3

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 ?？?570102；2. 急救與創(chuàng)傷研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；3. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院海島急救醫(yī)學(xué)創(chuàng)新單元2019RU013，海南?？?571199）

社區(qū)獲得性肺炎（CAP）指在院外因細(xì)菌、非典型病原體、病毒等感染引起的肺部疾患，主要有發(fā)熱、咳嗽、咳痰、伴或不伴有胸痛等癥狀［1］。目前臨床上以抗生素為主要治療手段，隨著抗生素濫用，耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，治療療效降低，甚至危及患者生命。因此亟需尋求新的治療手段，改變當(dāng)前窘局。中草藥的開發(fā)無疑是優(yōu)選途徑之一。白茅根又稱茹根、地筋等，是傳統(tǒng)中藥之一；具有涼血止血、清熱利尿等功效，可用于治療熱病煩渴、肺熱咳嗽等［2］。其主要成分有糖類、三萜類和黃酮類，相關(guān)研究顯示［3，4］：糖類為其主要活性成分，具有調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能；三萜類具有抗炎、抑菌等功效；此外，黃酮類具有抗氧化、抗炎、抑菌及免疫調(diào)節(jié)等作用。病原體入侵機(jī)體可引起大量炎性因子及自由基等毒性因子的形成，大量自由基的積累，可攻擊細(xì)胞生物膜引起脂質(zhì)氧化反應(yīng)，進(jìn)一步造成組織細(xì)胞損傷，在肺部感染中自由基的形成可加重肺泡細(xì)胞、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，影響疾病預(yù)后。翁梁等［5］研究示白茅根中黃酮類物質(zhì)具有清除氧自由基能力，表明其具有抗氧化能力。超氧化物歧化酶是機(jī)體重要抗氧化酶，可清除自由基，保護(hù)細(xì)胞避免自由基損傷，相關(guān)研究提示白茅根通過提高超氧化物歧化酶活性，達(dá)到清除自由基作用，提高抗氧化能力［6］。TLR4（Toll 樣受體4）是TLR 受體超家族成員之一，能識別感染因素并進(jìn)一步激活免疫炎癥信號通路［7］。TLR4/NF-κB 信號通路接受多種因素刺激而激活，介導(dǎo)TNF-α 和IL-6 等促炎因子的轉(zhuǎn)錄以及各種趨化因子的產(chǎn)生，信號通路的過度表達(dá)可引起炎癥因子大量釋放，加重組織損傷［8］。郭黎等［9］通過肺炎小鼠模型探究發(fā)現(xiàn)肺部感染的發(fā)病機(jī)制與NF-κB 通路激活相關(guān)，通過抑制該通路激活，可明顯改善肺炎小鼠肺組織病理狀態(tài)，調(diào)節(jié)其炎癥反應(yīng)水平。目前李昌靈等［10］研究示白茅根提取物對革蘭陰性/陽性菌、真菌均有抑制作用，且細(xì)菌療效較真菌作用強(qiáng)，但未對其抗炎相關(guān)機(jī)制進(jìn)行闡述。本研究通過檢測超敏C 反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）、IL-6、IL-8、TNF-α 及TLR4/NF-κB mRNA 表達(dá)水平，旨在探討白茅根對社區(qū)獲得性肺炎患者的療效及對TLR4/NF-κB 信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年11 月～2020 年9 月于海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科診治的120 例社區(qū)獲得性肺炎患者，采用隨機(jī)法將受試者分為試驗(yàn)組及對照組。對照組60 例，男性32 例、女性28 例；年齡35～76 歲，平 均（56.16±1.21）歲；病 程2～4 周，平 均（3.57±0.17）周；試驗(yàn)組60 例，男性29 例，女性31例；年齡33～77 歲，平均（55.78±1.35）歲；病程2～4周，平均（3.36±0.25）周。兩組資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者均符合中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［11］。（1）急性起病，伴有發(fā)熱、咳嗽、咳痰等癥狀；（2）胸部體格檢查提示有干濕性啰音；（3）血清學(xué)檢查示感染指標(biāo)異常（如白細(xì)胞數(shù)＞10×109/L）；（4）影像學(xué)提示片狀、斑片狀、網(wǎng)格狀等炎性浸潤性陰影，伴或不伴胸腔積液；滿足以上（1）～（3）項(xiàng)中任意1 項(xiàng)加第（4）項(xiàng)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合上述CAP 診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）與醫(yī)務(wù)工作人員溝通無礙；（3）年齡＞18 歲；（4）簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、肺部腫瘤、免疫缺陷等疾病患者；（2）妊娠及哺乳期女性；（3）意識不清或精神障礙者；（4）對中藥制劑過敏者。

1.3 方法

1.3.1 儀器與試劑 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；低溫高速離心機(jī)（美國Beckmancoulter 公司）；TRIzol 試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑（美國英杰生命技術(shù)有限公司）；PCR 儀器（美國ABI 公司）；白茅根（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房）；頭孢呋辛鈉、左氧氟沙星（悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司）。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 中藥制備：稱取白茅根30 g，洗凈，衡量400 mL 水，分別置入砂鍋中煮沸煎至200 mL 時(shí)，過濾藥渣，待煎劑放置恒溫時(shí)存入密封袋中保存；標(biāo)本采集：入院時(shí)分別抽取兩組靜脈血4 mL，待治療14 d 后，再次抽取兩組靜脈血4 mL，兩次標(biāo)本均使用離心機(jī)以3 000 r/min 速度離心15 min，按照ELISA 試劑盒相關(guān)說明進(jìn)行檢測IL-6、IL-8、TNF-α；CRP、PCT 可由本院檢驗(yàn)科檢查結(jié)果獲悉；Toll 樣受體4（TLR4）mRNA 及NF-κB mRNA 的表達(dá)水平測定：采用Trizol 分離提取外周血單核細(xì)胞總RNA，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒相關(guān)方法操作獲得cDNA，并根據(jù)SYBR Green PCR 試劑盒說明書操作進(jìn)行Q-PCR。在熒光定量PCR 儀上運(yùn)用溶解曲線驗(yàn)證PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，選用GAPDH 為內(nèi)參基因，兩組病例樣本TLR4/NF-κB mRNA 的相對表達(dá) 量為2-ΔΔCt。

1.3.3 治療方法 試驗(yàn)組：白茅根煎劑（200 mL，2付/d）＋頭孢呋辛鈉針（750 mg，3 次/d）+左氧氟沙星注射液（500 mg，1 次/d）靜脈滴注治療；對照組：頭孢呋辛鈉針（750 mg，3 次/d）+左氧氟沙星注射液（500 mg，1 次/d）靜 脈滴注治療，兩組均治療14 d。

1.3.4 療效判斷 （1）比較兩組發(fā)熱、咳嗽消退時(shí)間，胸部CT 炎癥吸收時(shí)間；（2）比較兩組療效效果參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［12］。痊愈：發(fā)熱、咳嗽、咳痰癥狀及胸部體征完全消失，感染指標(biāo)正常，影像學(xué)示炎癥完全吸收；好轉(zhuǎn)：發(fā)熱、咳嗽、咳痰癥狀、體征明顯減輕，感染指標(biāo)較前改善，胸部CT 示炎癥部分吸收；無效：持續(xù)存在發(fā)熱、咳嗽、咳痰等癥狀或癥狀體征、感染指標(biāo)、影像學(xué)檢查較前加重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組癥狀、胸部CT 改善時(shí)間比較

試驗(yàn)組發(fā)熱、咳嗽、咳痰消退時(shí)間及胸部CT 炎癥吸收時(shí)間均較對照組縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組癥狀、胸部CT 改善時(shí)間比較（d，n=60，±s）Tab 1 Comparison of improvement time of symptoms and chest CT between the two groups（d，n=60，±s）

表1 兩組癥狀、胸部CT 改善時(shí)間比較（d，n=60，±s）Tab 1 Comparison of improvement time of symptoms and chest CT between the two groups（d，n=60，±s）

組別對照組試驗(yàn)組t P發(fā)熱消退時(shí)間3.73±0.24 2.12±0.14 2.731＜0.05咳嗽、咳痰消退時(shí)間6.23±0.12 4.54±0.17 3.247＜0.05胸部CT 顯示炎癥吸收時(shí)間10.72±0.22 8.21±0.11 3.175＜0.05

2.2 兩組治療后治療效果比較

試驗(yàn)組總有效率（96.67%）高于對照組總有效率（85.00%），差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組治療后治療效果比較［n=60，n（%）］Tab 2 Comparison of curative effects between the two groups after treatment［n=60，n（%）］

2.3 兩組血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α 水平比較

治療前兩組血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后兩組CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α 均較前降低，且試驗(yàn)組較對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP、PCT 比較（n=60，±s）Tab 3 Comparison of serum IL-6，IL-8，TNF-α，CRP，PCT between the two groups（n=60，±s）

表3 兩組血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP、PCT 比較（n=60，±s）Tab 3 Comparison of serum IL-6，IL-8，TNF-α，CRP，PCT between the two groups（n=60，±s）

注：與同組治療前比較，*P＜0.05。

組別對照組試驗(yàn)組PCT(ng/mL)1.77±0.17 0.74±0.24*1.83±0.23 0.35±0.11*0.085 3.386＞0.05＜0.05 t P時(shí)間治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后IL-6(pg/mL)76.15±5.18 40.18±6.09*76.47±6.71 21.24±5.21*0.149 3.527＞0.05＜0.05 IL-8(pg/mL)54.08±8.17 31.64±2.11*54.16±10.22 22.41±3.02*0.091 3.247＞0.05＜0.05 TNF-α(pg/mL)73.42±4.23 43.28±9.51*73.74±3.58 26.64±8.69*0.133 3.437＞0.05＜0.05 CRP(mg/L)54.13±7.42 12.35±2.13*53.61±7.25 8.85±1.38*0.174 3.051＞0.05＜0.05

2.4 TLR4/NF-κB mRNA 表達(dá)水平比較

治療前兩組TLR4/NF-κB mRNA 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后兩組TLR4/NF-κB mRNA 表達(dá)水平均較前明顯降低，且試驗(yàn)組較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 兩組TLR4／NF-κB mRNA 表達(dá)水平比較（n=60，±s）Tab 4 Comparison of TLR4/NF-κB mRNA expression levels between two groups（n=60，±s）

表4 兩組TLR4／NF-κB mRNA 表達(dá)水平比較（n=60，±s）Tab 4 Comparison of TLR4/NF-κB mRNA expression levels between two groups（n=60，±s）

注：與同組治療前比較，*P＜0.05。

組別對照組試驗(yàn)組NF-κB mRNA 1.17±0.27 0.53±0.18*1.18±0.31 0.27±0.07*0.103 3.158＞0.05＜0.05 t P時(shí)間治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后TLR4 mRNA 1.36±0.21 0.57±0.15*1.33±0.17 0.26±0.09*0.131 3.287＞0.05＜0.05

3 討論

20 世紀(jì)末由世界衛(wèi)生組織公布的一項(xiàng)關(guān)于肺部感染相關(guān)資料顯示，社區(qū)獲得性肺炎發(fā)病率最高［13］。CAP 主要好發(fā)于老年患者，可能與其纖毛運(yùn)動能力減弱、肺泡彈性差有關(guān)，氣道黏液無法及時(shí)排除，病情遷延，合并多種感染時(shí)，病死率增高。據(jù)國內(nèi)外多項(xiàng)研究［14，15］：目前中國老年CAP 病死率約5%～15.4%，且病死率與年齡呈相關(guān)關(guān)系，其中重癥肺炎患者病死率約45.3%。感染引起的全身炎癥反應(yīng)，亦是增加病死率主要原因之一。所以選擇合適抗生素，控制炎癥反應(yīng)、殺滅病原菌，是改善預(yù)后的主要干預(yù)手段。近年，隨著抗生素的廣泛使用，病原菌發(fā)生結(jié)構(gòu)突變，耐藥性日趨嚴(yán)重，CAP 發(fā)病率逐年上升，其耐藥性亦逐漸增強(qiáng)［16，17］。病原體表面的脂多糖成分可通過激活NF-κB，啟動TNF-α、IL-8 及IL-17 的轉(zhuǎn)錄翻譯，激發(fā)“炎癥瀑布效應(yīng)”［18］。炎癥反應(yīng)的大量炎癥因子釋放時(shí)，可進(jìn)一步對機(jī)體組織、器官造成影響。糖皮質(zhì)激素作為抗炎的常用藥物，可顯著調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，但在伴發(fā)感染時(shí)可引起感染進(jìn)一步惡化、加重病情。而中藥具有廣泛的抑菌效果、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、耐藥率低、療效顯著等特點(diǎn)，使其成為抗菌藥物開發(fā)的熱點(diǎn)之一，并在抑制炎癥反應(yīng)過程中具有其獨(dú)特優(yōu)勢。中西藥聯(lián)合使用可有效抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，改善病人預(yù)后。

中醫(yī)將社區(qū)獲得性肺炎歸類于“風(fēng)濕肺熱”范疇，因風(fēng)熱外邪襲肺，肺失宣降，導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，以發(fā)熱、咳嗽、咳痰為主要表現(xiàn)，因此宣肺熱化痰為主要治療方法［19］。機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程亦是對病原體的抵御機(jī)制，炎癥過程的啟動由免疫細(xì)胞的模式識別受體（PRR）識別病原體相關(guān)分子模式（PAMP）介導(dǎo)，PRR（Toll 樣受體等）介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，誘發(fā)炎癥因子、促炎細(xì)胞因子的釋放［8］。TLR4 是一種重要的模式識別受體，以PAMP 識別配體，如革蘭陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖（LPS）、細(xì)菌內(nèi)毒素等，活化后通過MyD88 依賴性途徑或TRIF 依賴性途徑激活NF-κB，引起炎癥因子釋放，對炎癥信號起到級聯(lián)放大效應(yīng)［20］。研究表明肺部感染患者外周血中TLR4 處于高表達(dá)狀態(tài)［21］。NF-κB 是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其與細(xì)胞周期進(jìn)程、炎癥反應(yīng)以及多種疾病發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。NF-κB 通路包括經(jīng)典與非經(jīng)典途徑，炎癥及免疫反應(yīng)可激活NFκB，繼而NF-κB 通路相關(guān)分子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中并刺激或抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄［22］。NF-κB 經(jīng)典通路是各種PRR 引發(fā)信號傳導(dǎo)的共同通路，通過NF-κB 通路的激活介導(dǎo)TNF-α、IL-和IL-6 等促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄以及各種趨化因子的產(chǎn)生［23］。本研究結(jié)果顯示：試驗(yàn)組總有效率、發(fā)熱、咳嗽、咳痰消退時(shí)間、胸部CT 炎癥吸收時(shí)間均較優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示白茅根對CAP 具有顯著療效，短時(shí)間內(nèi)可明顯改善患者癥狀；兩組治療后血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α 及TLR4/NF-κB mRNA 等指標(biāo)較治療前明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且試驗(yàn)組較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示白茅根通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路活化，減少炎性介質(zhì)釋放，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕炎癥因子對肺泡毛細(xì)血管屏障的損傷，改善患者癥狀。蔣崇榮等［24］通過使用白茅根作用SD 大鼠膿毒血癥模型，發(fā)現(xiàn)白茅根能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞核NF-κB p65 的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)及肺泡毛細(xì)血管損傷；陳蘭英等［25］使用白茅根作用于阿霉素腎病大鼠，發(fā)現(xiàn)其通過抑制NF-κB 活化，抑制腎小球纖維化，達(dá)到改善腎功能等功效。相關(guān)研究均提示白茅根可抑制NF-κB 通路激活，改善疾病進(jìn)展，與本研究結(jié)果相似。

綜上，白茅根治療CAP 具有降低血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α 水平等功效，其機(jī)制與通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路的激活相關(guān)，達(dá)到下調(diào)炎癥因子釋放作用，改善臨床癥狀。本研究不足之處在于白茅根在社區(qū)獲得性肺炎中的多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)作用機(jī)制尚未明確，且需使用TLR4/NF-κB 通路阻斷劑明確其具體分子機(jī)制，為中草藥在治療社區(qū)獲得性肺炎的研發(fā)中提供理論基礎(chǔ)。