硝磺草酮抗性菌株的篩選及抗性hppd基因的克隆表達(dá)

張 磊 李 林

(1.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637000；(2.南京振旭生物科技有限公司，南京 210000)

草甘膦和抗草甘膦作物的組合在農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域超過20年的大面積持續(xù)應(yīng)用，對全球范圍農(nóng)田雜草的控制起到了非常大的作用[1]。然而，長期高劑量使用草甘膦造成了嚴(yán)重的環(huán)境危害和巨大的選擇壓力，已經(jīng)導(dǎo)致了40多種雜草對草甘膦產(chǎn)生了抗藥性[2-3]。草甘膦及其抗性基因替代組合的發(fā)掘和應(yīng)用，是植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域重要且緊迫的研究任務(wù)之一。

4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD，EC1.13.11.27)抑制劑類除草劑是近年來新開發(fā)的一類新型白化型除草劑，其除草機理是通過競爭性抑制植物酪氨酸代謝途徑中HPPD的活性，從而使質(zhì)體醌和生育酚的合成受阻，間接影響了類胡蘿卜素的合成和功能，使植物光合作用不能正常進(jìn)行，導(dǎo)致雜草葉片白化，組織壞死，最終死亡[3-5]。HPPD抑制劑類除草劑廣泛應(yīng)用于防治玉米田中的闊葉雜草和禾本科雜草，具有環(huán)境安全性高、作物安全性好和雜草抗性產(chǎn)生慢等優(yōu)點，被認(rèn)為是替代草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物靶標(biāo)除草劑[4-5]。HPPD抑制劑類除草劑主要品種有硝磺草酮、苯吡唑草酮和異噁唑草酮，其中硝磺草酮是用量最大的一類。目前，巴斯夫和先正達(dá)利用來自于燕麥的HPPD突變體AvHPPD-03開發(fā)出抗硝磺草酮的轉(zhuǎn)基因大豆SYHT0H2并已進(jìn)行了商業(yè)化生產(chǎn)[6-9]，而國內(nèi)僅克隆出了3個HPPD基因[10-12]，尚無高抗硝磺草酮的HPPD編碼基因的報道。

自然界微生物庫中存在廣泛的各類基因資源，本研究從除草劑污染的土壤中分離篩選到一株硝磺草酮高耐受菌株MST-5，從中克隆到硝磺草酮抗性基因Sthppd，利用E.coliBL21(DE3)對StHPPD進(jìn)行了異源表達(dá)和純化，研究了StHPPD對硝磺草酮的抗性，旨在為新型除草劑抗性基因的發(fā)掘和應(yīng)用提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料和培養(yǎng)基

L-酪氨酸購自百靈威公司(中國，上海)，分子生物學(xué)試劑購自大連寶生物公司和南京諾維贊生物科技有限公司，引物及測序服務(wù)委托上海生工生物公司。其他化學(xué)試劑(分析純)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。硝磺草酮、苯吡唑草酮和二酮腈(異噁唑草酮代謝物)購買自美國Sigma-Aldrich公司，分別用DMSO配置成300 mmol/L的母液，過濾除菌后保存于4 ℃冰箱。

LB培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L?；A(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MSM)：NaCl 1.0 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，加超純水至1 L，并調(diào)節(jié)pH至7.0。酪氨酸無機鹽培養(yǎng)基(TMSM)為MSM培養(yǎng)基添加1 g/L的酪氨酸。

1.2 抗性菌株的篩選分離

土壤樣品采自于南京某農(nóng)藥廠和安徽某農(nóng)藥廠表層土壤和下水道污泥。稱取2.0 g樣品加入到添加有2 000 μmol/L硝磺草酮的50 mL MSM培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/m富集培養(yǎng)5 d。然后，將5 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50 mL新鮮的MSM培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)5 d。經(jīng)過連續(xù)富集馴化5輪后，吸取1 mL上清培養(yǎng)液并稀釋涂布于TMSM平板上，挑取在平板上生長的單菌落反復(fù)劃線，獲得純培養(yǎng)物，并經(jīng)革蘭氏染色法篩選獲得其中的陰性菌。純化得到的革蘭氏陰性菌株轉(zhuǎn)接至含有500 μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上，挑取能在平板上生長的菌株，然后轉(zhuǎn)接到新的篩選平板上，轉(zhuǎn)接過程中逐漸增加篩選平板上硝磺草酮的濃度以增加選擇壓力，最終篩選出硝磺草酮高度耐受菌株。

1.3 抗性菌株對硝磺草酮的抗性測定

為比較抗性菌株對硝磺草酮的抗性情況，將篩選得到的抗性菌株轉(zhuǎn)接至TMSM液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/m條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5 000 r/m離心收集菌體，用TMSM液體培養(yǎng)基重懸菌體并調(diào)節(jié)OD600為10.0，以1%的接種量分別接種到含500、1 000、2 000、3 000、4 000和5 000 μmol/L硝磺草酮的20 mL TMSM液體培養(yǎng)基中，設(shè)置不接抗性菌株作為對照。于37 ℃、180 r/m培養(yǎng)60 h后檢測OD600值。

1.4 抗性菌株的16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

采用SDS-高鹽法提取抗性菌株基因組DNA，根據(jù)16S rRNA基因通用引物27F/1492R(表1)，PCR擴增抗性菌株的16S rRNA基因序列。PCR產(chǎn)物TA克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliDH5α。提取陽性克隆子質(zhì)粒并委托上海生工進(jìn)行測序。得到抗性菌株的16S rRNA基因序列提交到在線網(wǎng)站EzBioCloud(https:∥www.ezbiocloud.net/)中進(jìn)行序列比對。下載同源性高的模式菌株的16S rRNA基因序列，在MEGA 6.0軟件中，利用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.5 硝磺草酮抗性基因hppd的克隆

根據(jù)同屬的StenotrophomonasindicatrixWS40T的hppd基因(Locus tag: CR918_RS17620)序列，設(shè)計引物對Sthppd-F和Sthppd-R(表1)，以菌株MST-5基因組DNA為模板，PCR擴增Sthppd基因，并克隆到pMD18-T載體上，然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中。提取陽性克隆子的質(zhì)粒并對Sthppd基因進(jìn)行測序。通過NCBI數(shù)據(jù)庫中BLASTN和BLASTP對獲得的Sthppd基因序列進(jìn)行核酸和蛋白序列的比對分析。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.6 HPPD蛋白表達(dá)和純化

以MST-5菌株基因組DNA為模板，根據(jù)引物對pET-Sthppd-F和pET-Sthppd-R，PCR擴增其hppd基因。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，然后利用同源重組的方式克隆至線性化的pET-29a(+)載體。構(gòu)建好的pET-Sthppd表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。StHPPD重組蛋白在16 ℃、160 r/m搖床中過夜誘導(dǎo)表達(dá)，利用Co2+柱進(jìn)行蛋白純化。具體方法參考彭乾等[13]。

1.7 HPPD酶活檢測

在50 mmol/L PBS(pH 7.4)緩沖溶液中添加2 mmol/L 抗壞血酸，1 mmol/L FeSO4，0.2 mmol/L 4-HPP和25 μgStHPPD，構(gòu)建總體積為1 mL的酶促反應(yīng)體系，以不添加酶作為對照。將酶促反應(yīng)體系置于30 ℃反應(yīng)15 min后，沸水浴5 min終止反應(yīng)。樣品經(jīng)離心過濾后，利用HPLC檢測尿黑酸的生成量，HPLC檢測方法見1.10。

1.8 HPPD抗性測定

在1.7構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)體系中添加0～50 μmol/L 的硝磺草酮、苯吡唑草酮和二酮腈，于30 ℃反應(yīng)15 min后沸水浴5 min終止反應(yīng)，利用HPLC檢測尿黑酸的生成量。以不添加HPPD抑制劑時的酶活為100%，計算相對酶活。在GraphPad Prism 6軟件中利用非線性擬合計算不同抑制劑的半抑制濃度(IC50)值。

1.9 HPPD酶學(xué)性質(zhì)分析

將1.7構(gòu)建的酶促反應(yīng)體系置于10～50 ℃條件下測定StHPPD的最適反應(yīng)溫度，以30 ℃時的酶活為100%，計算相對酶活。配置3種50 mmol/L緩沖溶液，在pH 4.0至9.0范圍內(nèi)分析StHPPD的最適pH：檸檬酸緩沖液(pH 3.0～6.0)、PBS緩沖液(pH 6.0～8.0)和Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～9.0)。以在50 mmol/L PBS緩沖液中pH 7.0時的酶活為100%，計算相對酶活。在酶促反應(yīng)體系中分別加入1 mmol/L不同的金屬離子(Fe2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Co2+、Mn2+、Hg2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+和Ba2+)，5 mmol/L Urea，5 mmol/L 金屬螯合劑EDTA，5 mmol/L SDS和0.1%的DEPC，測定它們對酶活的影響，以添加Fe2+時的酶活為100%。

1.10 HPLC檢測方法

4-HPP、HGA和硝磺草酮的HPLC檢測方法參照彭乾等[13]。其中4-HPP和HGA的流動相為V(乙腈)∶V(水)=3∶7，水中添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸；硝磺草酮的流動相為V(甲醇)∶V(水)=55∶45，水中添加0.1%的磷酸；流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃；4-HPP、HGA和硝磺草酮的檢測波長分別為282、292和245 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝磺草酮抗性菌株的篩選

經(jīng)分離純化，從采集的土壤樣品中共獲得了96株能以酪氨酸為唯一碳源生長的細(xì)菌，分別編號為MST-1～MST-96。為從中篩選硝磺草酮抗性菌株，將96株菌分別逐漸轉(zhuǎn)接至含有500～5 000 μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上。在低濃度硝磺草酮(500 μmol/L)作為選擇壓力時，大部分細(xì)菌的生長不受抑制，從中篩選獲得了72株菌。然而，隨著硝磺草酮濃度的不斷提高，細(xì)菌的生長受到抑制，獲得的菌株也越來越少。在含有5 000 μmol/L硝磺草酮的TMSM平板上篩選到3株菌株，分別為MST-5、MST-32和MST-66。

為進(jìn)一步比較3株菌株對硝磺草酮的抗性，將它們分別接種于含有500～5 000 μmol/L硝磺草酮的TMSM液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)60 h后測定培養(yǎng)液的OD600，結(jié)果如表2所示。在含有500 μmol/L硝磺草酮的TMSM液體培養(yǎng)基中，菌株MST-5和MST-32的生長基本不受影響；然而，隨著硝磺草酮濃度的增加，菌株MST-5和MST-32的生長逐漸被抑制；相比較而言，菌株MST-5對硝磺草酮的抗性要稍好于MST-32。對于菌株MST-66，在含有500～5 000 μmol/L硝磺草酮條件下，其生長不受抑制。因此，3株菌株對硝磺草酮的抗性強度為：MST-66>MST-5>MST-32。

表2 菌株MST-5、MST-32和MST-66對不同濃度硝磺草酮的抗性Table 2 The resistance of strains MST-5, MST-32 and MST-66 to mesotrione

據(jù)文獻(xiàn)報道，細(xì)菌對HPPD抑制劑的抗性具有多種機制，而最常見的是體內(nèi)靶標(biāo)酶HPPD對除草劑不敏感以及降解酶將除草劑降解而獲得的抗性[18]。為研究菌株MST-5、MST-32和MST-66對硝磺草酮的抗性是來自靶標(biāo)酶抗性還是降解獲得的抗性，選取上述添加了500 μmol/L硝磺草酮的TMSM液體培養(yǎng)基，利用HPLC對培養(yǎng)基中的硝磺草酮含量進(jìn)行檢測。如圖1所示，硝磺草酮的出峰時間在5.9 min左右，處理(接種菌株MST-5、MST-32和MST-66)和對照(未接菌)中的硝磺草酮特征峰相互疊加，且峰面積基本一致，也沒有新的特征吸收峰的生成，表明硝磺草酮沒有被降解。因此菌株MST-5、MST-32和MST-66對硝磺草酮的抗性可能是來自靶標(biāo)酶抗性而非降解獲得的抗性。

圖1 菌株MST-5、MST-32和MST-66對硝磺草酮的降解能力Fig.1 HPLC analysis of the degradation of mesotrione by strains MST-5, MST-32 and MST-66

2.2 菌株MST-5的系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)16S rRNA基因序列分析，菌株MST-5、MST-32和MST-66分別為嗜麥芽窄食單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)、伯克氏菌屬(Burkholderiasp.)和節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)。鑒于節(jié)桿菌中沒有HPPD基因，其通過3，4-二羥基苯乙酸途徑(Homoprotocatechuate pathway)代謝酪氨酸[19]，因此節(jié)桿菌對HPPD抑制劑不敏感。而菌株MST-5對硝磺草酮的抗性要高于菌株MST-32，因此選擇菌株MST-5進(jìn)行后續(xù)研究。

菌株MST-5為革蘭氏陰性、好氧細(xì)菌，其在LB平板上生長2 d后，菌落為黃色圓形，邊緣光滑(圖2(a))。用透射電子顯微鏡觀察，MST-5菌體形態(tài)為桿狀，大小為0.9～1.0 μm× 2.1～2.2 μm(圖2(b))。PCR擴增得到菌株MST-5的16S rRNA基因序列長為1 441 bp。將其提交至EzBioCloud進(jìn)行序列比對，結(jié)果表明菌株MST-5與StenotrophomonasindicatrixWS40T相似性最高，為99.73%，其次為StenotrophomonaslactitubiM15T(99.66%)和StenotrophomonaschelatiphagaDSM 21508T(99.05%)。Neighbor-joining法構(gòu)建菌株MST-5的系統(tǒng)進(jìn)化樹，表明菌株MST-5屬于Stenotrophomonas屬，與StenotrophomonasindicatrixWS40T形成一個分枝(圖3)。因此將菌株MST-5初步鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌屬。

(a)菌落形態(tài)；(b)透射電鏡(放大倍數(shù)為10 000倍)照片。(a) Colony morphology; (b) Transmission electron micrograph (10 000×).圖2 菌株MST-5的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain MST-5

2.3 hppd基因的克隆

Blast分析表明，同一個屬的HPPD基因非常保守，其核酸序列和氨基酸序列相似性高達(dá)90%以上。雖然抗性菌株MST-5的基因組尚未測定，但和其親緣關(guān)系最近的菌株StenotrophomonasindicatrixWS40T的基因組序列已經(jīng)公布(登錄號：PEJS00000000.1)。因此，在StenotrophomonasindicatrixWS40T氨基酸序列文庫中，通過同源序列比對找到其HPPD(WP_032951734.1)以及對應(yīng)的hppd基因(Locus tag: CR918_RS17620)，并以此設(shè)計引物對Sthppd-F和Sthppd-R(表1)，以菌株MST-5基因組DNA為模板，利用PCR成功擴增出了hppd基因，命名為Sthppd。經(jīng)測序，Sthppd長為1 071 bp，GC含量為62%，編碼356個氨基酸。

同源序列分析表明，StHPPD和已報道的抗性HPPD序列一致性較低(圖4)。如：StHPPD與來自Burkholderiasp. BW-1的BkHPPD相似性為55%，與來自PseudomonasfluorescensP.J.874的PfHPPD相似性為51%，與來自Ensifersp. Ace-21 的EnHPPD相似性為51%，與來自Pseudomonassp. AM-H4的PsHPPD的相似性為47%，與來自Sphingobiumsp. TPM-19的SpHPPD的相似性為49%。

括號中的序號代表GenBank登錄號；節(jié)點上的數(shù)字表示Bootstrap值；刻度0.002表示序列偏差值。Accession numbers of sequences are given in parentheses. Bar, 0.01 substitutions per nucleotide position. Numbers at the nodes indicate the bootstrap values. Bar, 0.002 substitutions per nucleotide position.圖3 菌株MST-5基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree reconstructed by the neighbour-joining method based on 16S rRNA gene sequences of strain MST-5

2.4 StHPPD的表達(dá)與純化

為測定StHPPD的酶活，將Sthppd克隆至pET29a(+)表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)進(jìn)行異源表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過Co2+親和層析純化。SDS-PAGE分析表明純化的蛋白的分子量大約為42 000 u，與理論值40 100 u相符(圖5)。純化的StHPPD蛋白質(zhì)量濃度為436 μg/mL。

2.5 StHPPD的酶活及對不同HPPD抑制劑的抗性分析

利用HPLC檢測StHPPD的酶活，如圖6所示，不添加酶的對照只有4-HPP特征峰，出峰時間為9.7 min；而添加StHPPD的處理在3.9 min有一個新的特征峰生成，與HGA標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間一致。HPLC檢測結(jié)果表明StHPPD具有4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶的活性，可以在體外將4-HPP轉(zhuǎn)化成HGA。

為進(jìn)一步研究StHPPD對3種HPPD抑制劑類除草劑的抗性，利用HPLC檢測了StHPPD在添加有不同濃度的HPPD抑制劑時殘留的酶活，結(jié)果顯示，硝磺草酮、苯吡唑草酮和二酮腈對StHPPD的IC50分別為15.5、10.8和28.2 μmol/L。

2.6 溫度、pH、金屬離子及化學(xué)添加劑對StHPPD酶活影響

如圖7(a)所示，StHPPD的最適反應(yīng)溫度為30 ℃；在20～40 ℃范圍內(nèi)，StHPPD的酶活能夠保持在50%以上；當(dāng)溫度高于40 ℃時，StHPPD酶活快速下降；在50 ℃時，StHPPD基本喪失酶活。如圖7(b)所示，StHPPD的最適pH為7.0；pH為6.0～7.5，StHPPD酶活能保持在90%以上；當(dāng)pH為8.0時StHPPD酶活能保持在50%左右；當(dāng)pH<5.0或pH=9.0時，StHPPD基本檢測不到酶活。金屬離子和一些化學(xué)添加劑對StHPPD酶活的影響如表3所示。大部分金屬離子，如Al3+、Co2+、Hg2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+和Ba2+，嚴(yán)重抑制StHPPD酶活；只有Fe3+和Mg2+不影響StHPPD的酶活；加入5 mmol/L脲對StHPPD酶活基本沒影響，但加入EDTA、SDS和DEPC之后，StHPPD酶活完全被抑制。

表3 金屬離子和化學(xué)添加劑對StHPPD酶活的影響Table 3 Effects of metal ions and chemicals on StHPPD activity

3 討論與結(jié)論

HPPD抑制劑類除草劑被認(rèn)為是理想的抗除草劑轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)除草劑，近年來，HPPD抑制劑類除草劑抗性菌株的篩選及抗性基因的克隆成為當(dāng)前的研究熱點。目前已有近10種HPPD抑制劑類除草劑抗性菌株被分離出來[6-11]。本研究分離到一株硝磺草酮抗性菌株MST-5，初步鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)。該屬細(xì)菌的HPPD抑制劑抗性是首次報道。MST-5能夠耐受5 000 μmol/L的硝磺草酮，與能耐受250 μmol/L硝磺草酮的Sphingobiumsp. TPM-19相比[12]，Stenotrophomonassp. MST-5對硝磺草酮具有更高的抗性。

序列上方帶箭頭部分為StHPPD二級結(jié)構(gòu)，包括α螺旋和β折疊，相同的序列背景用紅色背景標(biāo)出，保守序列位點用方框標(biāo)出。黑色填充三角標(biāo)記的嚴(yán)格保守的殘基(His170，His248 和Glu332)是Fe(II)結(jié)合位點。Numbers above the amino acid sequences indicate the residue positions of StHPPD. The predicted StHPPD secondary structure is shown above the alignment with α-helices, β-strands, and turns. The conserved amino acid residues are emphasized in box and identical residues are shown with a red background. Strictly conserved residues (His170, His248 and Glu332) labeled with black filled triangles are Fe(II) binding site.圖4 HPPD氨基酸序列比對Fig.4 Multiple alignment of HPPD enzymes protein sequence

M：蛋白Marker；1：StHPPD純酶。Lane M: Standard protein molecular marker;Lane 1: Purified StHPPD.圖5 StHPPD的SDS-PAG檢測圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of StHPPD

圖6 StHPPD催化4-HPP生成HGA的液相色譜圖Fig.6 HPLC analysis of 4-HPP transformation by StHPPD

國內(nèi)外克隆獲得了多個HPPD抑制劑除草劑抗性HPPD基因[6～11]，其中有2個HPPD抗性基因突變體，分別是從Pseudomonasfluorescens的HPPD中篩選得到的突變體GW336[8]和從Avenasativa的HPPD中篩選得到的突變體339[9]，已經(jīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆生產(chǎn)中，并使轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)生了對異噁唑草酮和硝磺草酮的較強抗性。本研究從Stenotrophomonassp. MST-5中克隆HPPD基因Sthppd，并外源表達(dá)StHPPD。最近，Liu等[12]和彭乾等[13]分離到2個抗性HPPD，分別命名為SpHPPD和EnHPPD。SpHPPD和EnHPPD表現(xiàn)出廣譜的HPPD抑制劑抗性，硝磺草酮、苯吡唑草酮和二酮腈對SpHPPD的IC50為4.2～8.7 μmol/L，對EnHPPD的IC50為12.7～35.1 μmol/L。在本研究中3種HPPD抑制劑對StHPPD的IC50為10.8～28.2 μmol/L，與SpHPPD和EnHPPD處在同一個數(shù)量級水平上。這說明StHPPD對多種HPPD抑制劑類除草劑具有較高的抗性，是優(yōu)良的廣譜HPPD抑制劑類除草劑抗性基因資源，具有潛在應(yīng)用價值。

數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示；n=3。Data are shown as mean±SD. n=3.圖7 溫度(a)和pH(b)對StHPPD酶活的影響Fig.7 Effects of temperature (a) and pH (b) on the activity of StHPPD

同源序列分析結(jié)果顯示，StHPPD和已報道的抗性HPPD序列相似性僅為47%～51%，其C端序列相對保守，而N端序列則與已報道HPPDs差異較大。前人研究表明，HPPD一級結(jié)構(gòu)中的C末端氨基酸序列高度保守，是酶的活性中心，而N末端同源性較低，沒有催化功能，在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用[12,20]。Liu等[12]通過對已報道的4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，雖然基因序列相似性不高，但各HPPD蛋白中與Fe2+結(jié)合的2個His和1個Glu高度保守。我們預(yù)測的StHPPD一級結(jié)構(gòu)中也有三個催化活性中心Fe2+結(jié)合位點His166、His244和Glu332。這些結(jié)果說明StHPPD可能具有與已報道的HPPD蛋白類似的催化機制。

本研究分離到一株硝磺草酮高耐受菌株Stenotrophomonassp. MST-5，并從中克隆到硝磺草酮抗性基因Sthppd?？剐苑治霰砻鱏tHPPD對HPPD抑制劑類除草劑表現(xiàn)出較高的抗性，但其抗性機制和在轉(zhuǎn)基因植物中的抗性性能有待進(jìn)一步研究。本研究為抗HPPD抑制劑類除草劑轉(zhuǎn)基因作物的培育提供優(yōu)良的基因資源。