一株新型鴨呼腸孤病毒山東分離株的分離鑒定與遺傳進化分析

李雪松，孫 悅，石曉娜，宿 鑫，閆大為，王思琪，劉金華，李澤君

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

目前，呼腸孤病毒病已成為危害我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的主要疫病之一，該病毒可以感染番鴨、半番鴨、櫻桃谷肉鴨、麻鴨和鵝等水禽。引起水禽發(fā)病或者死亡，或者引起繼發(fā)感染造成更大的經(jīng)濟損失。該病首次在南非報道被發(fā)現(xiàn)，1997年傳入中國，大多在我國福建、浙江等南方地區(qū)鴨群發(fā)病傳播，是一種以肝臟、脾臟表面有多量白點，腎腫大、出血為主要病理變化的傳染病，因其最易感染番鴨，被稱之為番鴨呼腸孤病毒病[1]。

2005年開始，在我國廣東省、四川省等地發(fā)現(xiàn)可感染麻鴨、番鴨、半番鴨和櫻桃谷鴨等各種商品鴨的新毒株，后被學者稱為鴨呼腸孤病毒，該病毒引起的鴨呼腸孤病毒病死亡率為5%～20%[2-6]。2017年，在我國山東、河南、江蘇等地區(qū)的養(yǎng)鴨場中暴發(fā)了一種以脾臟腫大、出血、壞死為主要特征的新的鴨呼腸孤病毒病，因其致病性不同于先前描述的鴨呼腸孤病毒病，被稱為新型鴨呼腸孤病毒病。該病毒對雛鴨的危害特點尤為嚴重，番鴨、半番鴨的發(fā)病日齡主要為6～25日齡，其中以7日齡居多，病程5～7 d；櫻桃谷鴨發(fā)病日齡主要為10～30日齡。新型呼腸孤病毒發(fā)病率為5%～32.5%，病死率達4%～20%[7-10]。

2018年8月初，山東省某肉鴨場1日齡的櫻桃谷雛鴨出現(xiàn)了一種以雛鴨脾壞死為主要特征的疫病，初期鴨只精神萎靡、食欲降低，發(fā)病后很快出現(xiàn)急性傳播感染并引發(fā)較高死淘率。本研究從臨床采集發(fā)病鴨的肝臟、脾臟等組織病料中分離到1株病毒，并對分離到的病毒株進行PCR鑒定和測序分析，確定該毒株為新型鴨呼腸孤病毒。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 山東省某肉鴨場送檢的疑似新型鴨呼腸孤病毒感染的櫻桃谷肉鴨。

1.2 主要材料與試劑 GreenTaqTMMix和2× AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2 （Probe qPCR）試劑購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；病毒RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；SPF鴨胚購自中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所。根據(jù)GenBank中已有的DRV S1基因序列，利用Oligo軟件設計合成了一對DRV特異性引物，擴增目的基因大小為566 bp，其他鴨常見疫病擴增引物為本實驗室保存，鴨呼腸孤病毒熒光定量PCR上游引物EF為5'-CGCCTGATACTTTCCCTCCT-3'，下游引物ER為5'-TAAGTCCTGCCACCTGTGAG-3'，探針EP為FAM-ATCAAATCCCTCCAAAGCGCTAMRA，擴增片段總長為199 bp。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 病料的剖檢及樣品處理 剖檢觀察患病雛鴨臟器的病理變化，并取病變明顯的病鴨肝臟。剪碎后以1∶4的比例加入含1000 U/mL雙抗的PBS，研磨后于-40℃反復凍融3次，4℃、7000×g離心l0 min，取上清液無菌過濾后備用。

1.4 常見鴨病毒傳染病檢測 用實驗室禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、1型鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A Virus type 1，DHAV-1）、3型鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A Virus type 3，DHAV-3）、鴨呼腸孤病毒（Duck reovirus，DRV）、鴨星狀病毒（Duck astrovirus，DAstV）、鴨細小病毒（Duckling parvovirusis，DPV）、鴨瘟病毒（Duck enteritis virus，DEV）、鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV）和鴨腺病毒（Duck adenovirus，DAdV）的引物，對1.3處理好的樣品進行PCR或RT-PCR，確定引起該病的病原體。

1.5 病毒分離和檢測 上述1.2脾臟和肝臟樣品經(jīng)尿囊腔各接種12日齡SPF鴨胚5枚，0.2 mL/枚。置于37℃孵育，每12 h照胚1次，觀察7 d。棄除24 h內(nèi)死亡的鴨胚，對24 h后死亡的鴨胚進行解剖，觀察病變。收取死亡鴨胚的尿囊液、尿囊膜和胚體，其中尿囊膜和胚體以1∶10的比例加入10倍雙抗PBS后研磨。-20℃反復凍融3次，4℃、10 000×g離心10 min，取上清液后備用，將其命名為SDHZ。并利用實驗室建立的NDRV定量RT-PCR方法對提取的尿囊液、尿囊膜和胚體對病毒增殖的拷貝數(shù)進行檢測。

1.6 血凝（Hemagglutination，HA）試驗 分別取上述1.5中的上清液SDHZ，按照《中國獸藥典》附錄中的“血凝（HA）試驗”，分別對1%的雞紅細胞懸液進行血凝（HA）試驗，觀察分離株是否對雞血紅細胞產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。

1.7 病毒S1基因擴增 用病毒RNA提取試劑盒提取分離毒SDHZ的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對S1基因進行分段擴增。S1-1F：5'-GCTTTTTT CTTCTCTGCCCAT-3'，S1-1R：5'-TTGTAGATCT GCCACCGTCGA-3'；S1-2F：5'-ACTTTCCCTCC TCCCCTACCA-3'，S1-2R：5'-GATGAATAGCTC TTCTCAT-3'，其中S1-1擴增750 bp，S1-2擴增片段為969 bp。按GreenTaqTMMix試劑說明書進行PCR，取10 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并送至北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序。

1.8 目的基因同源性比對及分析 對SDHZ株S1基因及其編碼的Sigma C氨基酸測序結果利用MEGA6和DNAStar軟件進行比對分析，繪制系統(tǒng)進化樹，并對Sigma C蛋白氨基酸進行同源性分析。

2 結果

2.1 解剖病理和鴨常見病毒性疾病PCR鑒定 患病鴨剖檢可見脾臟出現(xiàn)腫大、出血、壞死（圖1A），肝臟大面積出血。用AIV、NDV、DHAV-1、DHAV-3、DRV、DAstV、DPV、DEV、DuCV、DAdV的實驗室鑒定引物，經(jīng)PCR或RT-PCR檢測結果顯示，樣品PCR鑒定為DRV陽性，鴨其他主要常見病毒PCR均為陰性（圖1B）

圖1 臨床患病雛鴨剖檢脾臟病變（A）和PCR鑒定（B）Fig.1 Spleen lesions (A) and PCR identification (B) of clinical ducklings

2.2 病毒分離 將病料樣品離心過濾后，經(jīng)尿囊腔接種12日齡鴨胚，接種48～120 h后鴨胚開始死亡，死亡鴨胚的病變主要表現(xiàn)為活力減弱，胚體發(fā)育不良，水腫和出血（圖2）。DRV定量PCR檢測收集的鴨胚病毒拷貝數(shù)為：鴨胚胚體研磨液（病毒拷貝數(shù)為19492）＞鴨胚尿囊液（病毒拷貝數(shù)為1108）＞鴨胚尿囊膜（病毒拷貝數(shù)為572），將該分離株命名為鴨呼腸孤病毒SDHZ分離株。

圖2 病料接種鴨胚的病變Fig.2 Lesion of duck embryo inoculated with the sample

2.3 血凝（HA）試驗 對樣品進行血凝（HA）試驗，檢測結果顯示該分離株SDHZ對1%雞血紅細胞無血凝活性（圖3）。

圖3 樣品血凝試驗測定Fig.3 The hemagglutination test of the clinical sample

2.4 S1基因PCR結果 以病毒分離株SDHZ基因組為模板，提取病毒RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄對病毒S1基因進行分段PCR擴增后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析，得到S1基因約為750 bp和S2基因約為969 bp，與預期結果一致（圖4）。

圖4 病毒分離株的S1基因分段PCR擴增結果Fig.4 PCR amplification of the isolate S1 gene

2.5 S1基因進化樹和sigma C蛋白氨基酸同源性分析 將測序得到的S1基因序列與GenBank中的DRV、MDRV和ARV的參考毒株序列進行進化樹分析，分離株SDHZ與我國流行的DRV處于同一分支（圖5A），且其sigma C蛋白氨基酸與參考毒株的同源性達到了94.5%～98.7%（圖5B）。

圖5 鴨呼腸孤病毒SDHZ分離株S1基因核苷酸序列進化樹（A）和SigmaC氨基酸同源性（B）Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on S1 gene (A) and homology analysis of amino acid of protein Sigma C (B) of DRVs

3 討論

近幾年，在我國肉鴨養(yǎng)殖地區(qū)出現(xiàn)一種以脾臟壞死為主要特征的疾病，該病主要造成病患雛鴨精神狀態(tài)差，飲水和采食量均下降，并伴有脾臟壞死后的機體免疫力下降引起的繼發(fā)感染，造成更高的死亡率；耐過鴨出現(xiàn)發(fā)育受阻、生長緩慢，成為僵鴨，經(jīng)研究證實新型鴨呼腸孤病毒是造成該病的主要病原[6-8]。該新型鴨呼腸孤病毒病具有發(fā)病日齡小、病情發(fā)展快、容易快速傳播的特點，是以脾臟腫大、出血、壞死為主要臨床特征的疾病，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[9-10]。

本研究通過SPF鴨胚從病料中分離得到1株DRV山東分離株，進化樹和同源性分析發(fā)現(xiàn)，分離株SDHZ與我國流行的DRV處于同一分支，且其Sigma C蛋白氨基酸與參考毒株的同源性達到了94.5%～98.7%，是我國流行的DRV分離株，并且通過DRV熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn)該病毒感染鴨胚后病毒主要在胚體中增殖，其次是尿囊液和尿囊膜。該病毒主要采用SPF鴨胚進行分離，避免了因為非本源宿主（如雞胚、LMH細胞或者BHK細胞）對病毒毒力和序列的影響，該研究結果也為今后鴨呼腸孤病毒病疫苗及其防制技術研究提供了理論參考。