NIS基因轉(zhuǎn)染對(duì)肝細(xì)胞癌NIS蛋白表達(dá)及攝碘功能的影響

范義湘，易紫薇，胡煜麟，張宏嘉，林美珍，陳潔芳，肖漢

1.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，廣東廣州510900；2.廣東省第二人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，廣東廣州510317

前言

肝細(xì)胞癌（HCC）是我國(guó)高發(fā)腫瘤，目前根治性切除、肝動(dòng)脈栓塞化療等可以取得較好的近期療效，但復(fù)發(fā)率高、遠(yuǎn)期療效不理想，尤其對(duì)于肝癌轉(zhuǎn)移瘤的治療更為困難［1］。鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（Sodium/Iodine Symporter, NIS）是甲狀腺濾泡細(xì)胞調(diào)節(jié)碘攝入的膜蛋白通道，既往報(bào)道采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使低分化或未分化甲狀腺癌等腫瘤具備攝碘功能，為腫瘤的核素靶向治療提供新思路［2］。本研究采用轉(zhuǎn)染外源性NIS 基因，上調(diào)HCC 細(xì)胞NIS 蛋白表達(dá)，使HCC 細(xì)胞具備攝碘功能，為HCC提供新的治療方法。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

總RNA 提取試劑Trizol reagent 和脂質(zhì)體lipofectamine 2000、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自Invitrogen 公司。RT-PCR 試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRI等購(gòu)自Takara公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒等購(gòu)自O(shè)mega 公司。Triton X-100 購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。Na125I為成都中核高通同位素公司生產(chǎn)，放射化學(xué)純度99.7%，無(wú)載體，pH 8.0。NIS 擴(kuò)增片段上游引物序列為：5'-CTCCCTGCTAAACGACTCCAG-3'，下游引物序列為：5'-AACAGACGATCCCTCATTGGTG-3'，購(gòu)自Invitrogen公司。人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司。核酸蛋白分析儀為美國(guó)Beckman 公司DU-530 型，基因擴(kuò)增儀為美國(guó)Perkin Elmer 公司PE-460 型，放射性γ 計(jì)數(shù)器為上海核福光電有限公司SN-682 型，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD FACSCanto II 型，熒光倒置顯微鏡為德國(guó)Leica DMi8型。

1.2 人肝癌細(xì)胞株HepG2培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)［3］，選擇人肝癌細(xì)胞株HepG2 作為研究對(duì)象。以DMEM 為培養(yǎng)液，培養(yǎng)液均含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清及100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)。定期采用含0.25%胰酶EDTA 溶液消化傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 PCR擴(kuò)增人NIS（hNIS）基因片段測(cè)序克隆

參照既往研究方法［4］，采用Trizol 法提取人8505C 細(xì)胞總的RNA，并設(shè)計(jì)NIS 基因的1 對(duì)引物。以逆轉(zhuǎn)錄合成的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段并用T4DNA 連接酶將其直接與克隆載體pUCmT 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL Blue。將含有正確hNIS 序列的重組質(zhì)粒pUCmThNIS 及真核載體pcDNA3經(jīng)HindⅢ和XbaI雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒pcDNA3/hNIS。

1.4 體外NIS轉(zhuǎn)染

在6 孔培養(yǎng)板中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞HepG2，每孔細(xì)胞數(shù)約為5×105。以上述相同方法培養(yǎng)并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待生長(zhǎng)密度達(dá)到90%以上時(shí)，采用電轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對(duì)照組細(xì)胞不轉(zhuǎn)染NIS基因。

1.5 Western-Blot法測(cè)定NIS基因表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，去培養(yǎng)上清液，用PBS液洗滌細(xì)胞2次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液150 μL，以細(xì)胞刮將細(xì)胞刮取，收集到細(xì)胞離心管，冰浴20 min后于4 ℃、12 000 g離心15 min，收集上清液。瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后照相。Kodak Digital Science ID軟件系統(tǒng)掃描分析，測(cè)定光密度值并計(jì)算NIS/GAPDH光密度比值［5］。其結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 細(xì)胞攝碘率測(cè)定

按以往研究方法［6］，于轉(zhuǎn)染后24 h，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約1×105，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)至細(xì)胞約80%融合時(shí)吸掉培養(yǎng)液，Hanks平衡鹽溶液（HBBS）洗滌1次，以微量加樣器（0～50 μL）加入含Na125I 13.7 kBq（0.37 μCi）的培養(yǎng)液，37 ℃溫育搖床振蕩24 h。收集細(xì)胞置入測(cè)量管，用放射性γ 計(jì)數(shù)器測(cè)量每分鐘放射性計(jì)數(shù)（T），之后離心去上清液，細(xì)胞沉淀用HBBS洗滌2 次，離心去上清液，測(cè)定結(jié)合于細(xì)胞的每分鐘放射性計(jì)數(shù)（B）。對(duì)照組和NIS 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞攝碘率以B/T%表示，每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣品。

1.7 DAPI染色檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡

取上述培養(yǎng)后消化的HepG2 細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約1×105，加入含Na125I 13.7 kBq（0.37 μCi）的培養(yǎng)液，37 ℃溫育搖床振蕩24 h。收集細(xì)胞置入測(cè)量管，置于6 孔培養(yǎng)板，每孔約1×106，培養(yǎng)72 h 后以PBS 液洗滌細(xì)胞2 次，以4%多聚甲醛在4 ℃固定細(xì)胞30 min，固定過(guò)的細(xì)胞再以PBS 洗滌2 次，然后以含0.1% Triton X-100 的0.1%檸檬酸鈉溶液于4 ℃孵育細(xì)胞5 min，加入DAPI于4 ℃暗箱孵育10 min，360 nm紫外線激活，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞染色。計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡（×400）下熒光染色細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，以前者除以后者為凋亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞NIS表達(dá)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組NIS 蛋白電泳條帶粗濃、寬厚，對(duì)照組條帶細(xì)小、稀疏（圖1），NIS/GAPDH 光密度比值在實(shí)驗(yàn)組平均值為0.49±0.12，對(duì)照組為0.18±0.11。經(jīng)比較，實(shí)驗(yàn)組HepG2 細(xì)胞NIS 表達(dá)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組（t=2.693,P<0.05），說(shuō)明經(jīng)NIS 基因轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞已表達(dá)NIS蛋白。

圖1 HepG2細(xì)胞NIS蛋白表達(dá)的Western-Blot檢測(cè)結(jié)果Fig.1 NIS protein expression in HepG2 cells was detected by Western-Blot assay

2.2 HepG2細(xì)胞攝碘率比較

培養(yǎng)板每孔細(xì)胞加入的Na125I經(jīng)γ計(jì)數(shù)器測(cè)量，其放射性總計(jì)數(shù)T（Total,T）為89 720 CPM（counts/min）。實(shí)驗(yàn)組HepG2 細(xì)胞所攝取的Na125I 放射性計(jì)數(shù)B（Binding, B）平均為（16 528±5 200）CMP，經(jīng)計(jì)算其攝碘率B/T%平均為（18.4±5.8）%。對(duì)照組HepG2細(xì)胞所攝取的Na125I放射性計(jì)數(shù)B平均為（1 820±1 610）CPM，經(jīng)計(jì)算攝碘率B/T%為（1.9±1.8）%。兩者比較具有顯著性差異（t=36.842,P<0.05），即經(jīng)NIS基因轉(zhuǎn)染后，實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞攝碘率顯著提高。

2.3 細(xì)胞凋亡測(cè)定

HepG2細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后鏡下呈藍(lán)白色熒光。凋亡細(xì)胞呈核濃縮，染色加深，或者核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一側(cè)。有些細(xì)胞表現(xiàn)為核碎裂呈大小不等的圓形小體，被細(xì)胞膜包繞，形成凋亡小體。實(shí)驗(yàn)組具有凋亡特征的染色細(xì)胞數(shù)多于對(duì)照組（圖2）。細(xì)胞經(jīng)稀釋并調(diào)整細(xì)胞濃度后，顯微鏡下每個(gè)高倍視野內(nèi)（×400）細(xì)胞數(shù)約70個(gè)，實(shí)驗(yàn)組含有核凋亡特征的細(xì)胞數(shù)為10～14個(gè)，實(shí)驗(yàn)組凋亡率平均為（19.2±5.3）%，對(duì)照組高倍視野下凋亡細(xì)胞數(shù)為2～5個(gè)，凋亡率為（5.8±3.1）%，顯著低于實(shí)驗(yàn)組（t=3.086,P<0.05）。

圖2 NIS表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞攝碘-125后細(xì)胞凋亡的影響（×400）Fig.2 Effects of NIS protein expression on apoptosis of HepG2 cell after iodine-125 uptake(×400)

3 討論

HCC是世界5大最常見(jiàn)腫瘤之一，占中國(guó)癌癥發(fā)病率第2 位和病死率的第1 位，在亞洲的一些地區(qū)，HCC是癌癥死亡最常見(jiàn)的原因［1,7］。

NIS是一種介導(dǎo)碘轉(zhuǎn)運(yùn)的糖化膜蛋白，即所謂的“碘泵”，主要位于甲狀腺細(xì)胞基底膜，其功能主要是借助鈉/鉀交換產(chǎn)生的鈉離子濃度梯度，逆濃度轉(zhuǎn)運(yùn)血液內(nèi)活性碘進(jìn)入細(xì)胞，從而可使細(xì)胞內(nèi)碘含量為血漿的20～200倍［8］。它實(shí)現(xiàn)了甲狀腺組織攝取碘并進(jìn)行甲狀腺激素的生物合成，實(shí)現(xiàn)了甲狀腺功能亢進(jìn)和分化型甲狀腺癌的顯像診斷和放射性碘治療。因此，NIS是細(xì)胞濃聚碘并進(jìn)行放射性碘治療的基礎(chǔ)［9］。1996年有學(xué)者首先從FPTL-5細(xì)胞的cDNA文庫(kù)克隆出鼠NIS基因［10］，隨后另有學(xué)者采用針對(duì)鼠NIS cDNA序列的引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增出hNIS的細(xì)胞cNDA片段，并從人甲狀腺細(xì)胞cNDA文庫(kù)中克隆出hNIS。hNIS基因位于19號(hào)染色體，整個(gè)編碼區(qū)由15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，其開(kāi)放閱讀框架為1 929個(gè)核苷酸，編碼643個(gè)氨基酸殘基［10-11］。隨著NIS結(jié)果和功能的闡明，采用提取hNIS mRNA，以此為起始原料經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的NIS基因克隆到含有巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，再將擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞NIS基因表達(dá)，這對(duì)于不表達(dá)NIS的HCC等惡性腫瘤，為實(shí)施放射性治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新思路［12］。隨著基因轉(zhuǎn)染方法的應(yīng)用，使不表達(dá)NIS的腫瘤具備攝碘功能，如失分化甲狀腺癌、未分化甲狀腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肺癌等，具備攝碘功能而實(shí)施放射性內(nèi)照射治療［12-15］。有研究發(fā)現(xiàn)用hNIS基因轉(zhuǎn)染無(wú)攝碘功能的鼠甲狀腺癌細(xì)胞，其攝碘能力提高了60倍，從而為難治性腫瘤的放射性碘治療開(kāi)辟了新思路［16］。本研究將NIS基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至原發(fā)性肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞，經(jīng)Western-Blot方法檢測(cè)出轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具備NIS蛋白表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有NIS表達(dá)。因?yàn)檗D(zhuǎn)染后細(xì)胞具備了NIS蛋白通道，從而具有攝碘功能，其平均攝碘能力達(dá)18.4%，為未轉(zhuǎn)染組的9.6倍，與目前類似研究結(jié)果接近［15］。因此，我們認(rèn)為HCC細(xì)胞表達(dá)NIS基因和蛋白，并具備攝碘能力，是基因轉(zhuǎn)染的結(jié)果。放射線可引起腫瘤細(xì)胞凋亡［3,16］。本研究轉(zhuǎn)染組細(xì)胞因?yàn)閿z取125I引起細(xì)胞改變，靶向?yàn)榧?xì)胞呈核濃縮，染色加深，或者核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一側(cè)，有些細(xì)胞甚至出現(xiàn)核碎裂，形成凋亡小體［17-18］。而未轉(zhuǎn)染NIS的對(duì)照組具有凋亡特征的染色細(xì)胞數(shù)較少。

綜上所述，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染NIS 基因，使HCC 細(xì)胞具備攝碘功能，放射性碘引起細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)。