超聲波輔助—酶法提取積雪草總苷及其抗腫瘤作用研究

沈 春 陳 文 王湘君 杜長臻 蘇利興 林凌彬 楊順雨海南熱帶海洋學(xué)院理學(xué)院 海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院

查閱相關(guān)大量文獻(xiàn)可知，積雪草在眾多天然藥物中作為一種具有特殊研究意義的藥物，它有著和其他中藥相同的良好藥性，在自身優(yōu)點方面，積雪草總苷的藥性偏涼，具有清熱解毒的功效，最重要的是它的副作用非常小，這點是很多同類藥物都不具備的，且積雪草中的其他多類成分也有著不同的藥效，這就使得它在藥物研究這一方面具有很高的地位以及研究價值。本文擬用超聲波輔助-酶法來提取積雪草總苷，利用超聲波輔助-酶法的提取優(yōu)點，獲取積雪草總苷的最佳提取生產(chǎn)工藝。同時，為了充分了解其在藥理方面的作用，對積雪草總苷的抗腫瘤作用也進(jìn)行了相關(guān)研究分析。

1 前言

積雪草，傘形科積雪草屬的干燥全草，主要分布于陜西、四川、云南、海南等多個省區(qū)，生長環(huán)境要求極低，生性十分強(qiáng)健，而且繁殖速度也非?？欤虼怂囊撰@取性也就不言而喻；積雪草在我國的中藥史上出現(xiàn)的很早，到如今它的很多中藥用途都被前人總結(jié)出來，發(fā)現(xiàn)它外用和內(nèi)用皆可。主要用于腹瀉、中暑、解毒、消腫以及跌打損傷等多種常見病癥的治療，用藥范圍十分廣泛[1-3]。積雪草總苷作為積雪草多個主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化以及抗抑郁和一定程度上改善人智力的顯著功效[4-5]；在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不斷地發(fā)展和完善的進(jìn)程中，積雪草總苷的多種提取方法也不斷地出現(xiàn)，而且其純化方法也逐漸成熟，所以對積雪草總苷的提取工藝以及抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行相對研究，有利于它的藥用價值的提升，同時也為積雪草總苷的潛在價值開發(fā)提供理論性參考。

2 積雪草總苷的研究現(xiàn)狀

積雪草由于其各種特性，在天然藥物的研究中已成為一項研究熱點，而且在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也普及的十分廣泛。癌癥問題在多種疾病問題中名列前茅，成為醫(yī)學(xué)界的一大難點，因此對積雪草總苷的提取純化工藝與抗腫瘤研究的相關(guān)文獻(xiàn)也如雨后春筍般出現(xiàn)。劉友平[6]等以靜態(tài)飽和吸附量和洗脫率為參照標(biāo)準(zhǔn)，比較不同種類的大孔樹脂分離和純化積雪草總苷，再對積雪草總苷的洗脫率等作為指標(biāo)，篩選出最佳樹脂吸附工藝。李濤[7]等先進(jìn)行單因素試驗，以提取方法為試驗變量，確定積雪草總苷的最佳提取方法為超聲法，再通過正交實驗對影響積雪草苷提取率的四種影響因素進(jìn)行實驗統(tǒng)計分析得出最優(yōu)提取工藝條件。杜建平[8]總結(jié)出各種影響成丸的因素，并結(jié)合動物體的內(nèi)外胃粘膜表面實驗和體外釋放度兩種測試結(jié)果，以最佳處方研制出具有緩釋功能的積雪草總苷素丸，而且產(chǎn)率也十分可觀，為積雪草總苷向產(chǎn)藥的方向發(fā)展提供了很大的依據(jù)以及相關(guān)方法。

3 積雪草總苷的提取方法比較及純化工藝

現(xiàn)如今積雪草總苷的提取方法有酶法、熱回流法、水煎煮法、超臨界萃取法、閃式提取法等多種有效提取方法。酶提取法是天然藥物中最常見的提取方法之一，但酶法提取要求較高，ph要求極為嚴(yán)謹(jǐn)精細(xì)，有時用單一酶又不能達(dá)到較好的結(jié)果，必須多種酶同時作用，且用完的酶不能回收，使得提取劑浪費較為嚴(yán)重。該法通過酶破壞細(xì)胞壁使細(xì)胞中所需成分溶于溶劑中，達(dá)到提取目的。但不足之處是提取過程中細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等其他有效成分也會隨之溢出；熱回流法的過程中成分易被破壞，而且效率也不能達(dá)到期望值，產(chǎn)率較低；水煎煮法雖操作過程簡單，且易得到所需產(chǎn)物，但提取的成分雜質(zhì)較多，包含多種其他成分，使最終產(chǎn)物達(dá)不到提取標(biāo)準(zhǔn)；超臨界萃取法萃取率很高且其萃取流體非一次性，可循環(huán)使用，但操作過程卻極其復(fù)雜，所需設(shè)備十分昂貴，耗資過多，而且反應(yīng)中的條件難以控制，易在實驗過程中產(chǎn)生較大的誤差性；閃式提取法具有成本不高，提取率高，操作性較強(qiáng)等多種優(yōu)點，但操作危險[9-11]。因此，總結(jié)各種提取方法的優(yōu)缺點，本文則采用超聲波輔助-酶法來提取積雪草總苷，將超聲波法用于輔助酶法，彌補(bǔ)酶法的缺點。超波輔助-酶法首先需進(jìn)行單因素實驗，比較各種酶的作用，發(fā)現(xiàn)纖維素酶提取效果最明顯，因而在積雪草中加入一定量的纖維素酶來破壞積雪草的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，使有效成分易溶出到提取液中，并在不同的料液比中加入相對濃度的乙醇進(jìn)行水浴回流加熱，超聲提取出提取液并離心。再進(jìn)行正交實驗比較酶解溫度和用量、料液比、超聲提取時間對積雪草苷提取率的影響大小關(guān)系，最終確定最佳提取工藝并提取出積雪草總苷這種所需成分。積雪草總苷的常用純化工藝包括樹脂吸附法、殼聚糖絮凝法[12]。大孔樹脂廣泛運(yùn)用于各種天然藥物的成分的分離純化，種類較多，提取成分在純化時可選擇性高，有效成分間的比例及種類可充分的保留。

4 積雪草總苷的抗腫瘤作用

近些年來，惡性腫瘤致死率在眾多病癥中穩(wěn)居首位，患病率更是快速升高，在天然藥物中尋求和開發(fā)抗腫瘤作用的藥物成分，一直是整個醫(yī)學(xué)界乃至整個社會的焦點和方向。淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的贅生物細(xì)胞群就會形成腫瘤，積雪草總苷是在不影響正常運(yùn)行的淋巴細(xì)胞的前提下，通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖起到抗腫瘤的作用。周[13]等以人的胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞等癌癥細(xì)胞株作為實驗瘤株，用MTT法檢測這些瘤株的增殖速度受積雪草總苷的影響程度，以及運(yùn)用流式細(xì)胞儀，免疫印跡法等各種醫(yī)療器械和醫(yī)療手段研究積雪草總苷對腫瘤細(xì)胞的周期和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的增殖有著抑制作用。姚錦英[14]利用A459細(xì)胞建立裸鼠荷瘤細(xì)胞模型并利用HE染色法等一系列實驗和方法，對比模型組發(fā)現(xiàn)積雪草總苷不僅能抑制腫瘤細(xì)胞的生長還可以令其部分壞死而起到抗腫瘤作用。

5 結(jié)語

綜上所述，對積雪草總苷的特殊藥理作用及提取方法有了一定的了解，它在未來醫(yī)學(xué)上的作用和開發(fā)的潛力是毋容置疑的；因此，對積雪草總苷更深層次的研究是必要的，既可以加速突破現(xiàn)有的相關(guān)理論范圍，也為后續(xù)開發(fā)和投入臨床的進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。本實驗選擇超聲波輔助-酶法，通過超聲波以機(jī)械手?jǐn)鄡?yōu)先將細(xì)胞壁破碎，加快物質(zhì)運(yùn)動分子的運(yùn)動速率和頻率，使溶劑的滲透性增加，再利用酶對細(xì)胞壁進(jìn)行二次降解，兩者有效結(jié)合促進(jìn)積雪草總苷的溶出效率，達(dá)到實驗?zāi)康模徽麄€實驗過程耗時少，最終的提取率也比較可觀，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)可以為后續(xù)研究積雪草總苷的提取提供參考。