高效液相色譜法測定莪術(shù)油乳膏含量*

李文靜，劉軍，李宏鈴，包亞男，朱紅，洪博

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省齊齊哈爾市結(jié)核病防治院，齊齊哈爾 161006)

莪術(shù)油乳膏為齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院自制制劑，以莪術(shù)油為主要原料藥，用于乳腺疾病的防治。李偉澤等[1]報道以莪術(shù)二酮和吉馬酮為主要活性成分的乳腺康凝膠膏劑治療乳腺增生療效顯著，且未見不良反應(yīng)。莪術(shù)醇通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)從而介導(dǎo)抗乳腺癌作用[2]；β-欖香烯經(jīng)過葉酸修飾被制成納米脂質(zhì)體，體內(nèi)外表現(xiàn)出優(yōu)異的乳腺癌細(xì)胞靶向治療作用[3]。筆者在本實驗以莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮和β-欖香烯為研究對象，建立簡便、準(zhǔn)確的高效液相色譜法測定莪術(shù)油乳膏中4種主要活性成分含量，以期為建立莪術(shù)油乳膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 魯能瑞虹高效液相色譜LC-1000D系統(tǒng)(山東魯能瑞虹化工儀器有限公司，包括四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱，紫外檢測器等)，安捷倫(Agilent)TC-C18色譜柱(美國安捷倫科技股份有限公司)，JP-500C-8中藥材粉碎機(jī)(浙江永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司)，BS124S電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量：0.01 mg)，KQ3200E超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 莪術(shù)二酮對照品(批號：111800-201001，含量：98.5%)、莪術(shù)醇對照品(批號：100185-200506，含量：98.5%)、吉馬酮對照品(批號：111665-201204，含量：98.5%)、β-欖香烯對照品(批號：100268-200401，含量：99.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院。莪術(shù)(批號：20150329)藥材均購自亳州市國峰藥業(yè)銷售有限公司，產(chǎn)地為安徽亳州，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中藥研究室郭麗娜教授鑒定為姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis的干燥根莖。無水乙醇、磷酸(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20160629)，色譜純甲醇、乙腈(ThermoFisher 科技有限公司，甲醇批號：40203-15309，乙腈批號：30281-27405)，純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號：20180521)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：安捷倫(Agilent)TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相：乙腈(A)-水(B)溶液梯度洗脫。洗脫程序：0～7 min，80%A；>7～12 min，80%→100% A，每次進(jìn)樣間隔用80%乙腈平衡。檢測波長：216 nm，柱溫25 ℃，流速：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。

2.2貯備液的制備

2.2.1對照品貯備液的制備 分別精密稱取各對照品莪術(shù)二酮(1)16.2 mg、莪術(shù)醇(2)10.8 mg、吉馬酮(3)10.4 mg、β-欖香烯(4)26.0 mg于10 mL量瓶，配制成莪術(shù)二酮1.62 mg·mL-1、莪術(shù)醇1.08 mg·mL-1、吉馬酮1.04 mg·mL-1、β-欖香烯2.60 mg·mL-1的混合對照品貯備液。

2.2.2供試品溶液的制備 取莪術(shù)油乳膏樣品(本實驗室自制，取莪術(shù)藥材10 g粉碎，置索氏提取裝置，以水提取，最終得提取液50 mL。取莪術(shù)油提取物10 mL，加白凡士林18 g、十六醇28 g、PEG-8蜂蠟18 mL和單硬脂酸甘油酯32 g于研缽，水浴加熱至75 ℃熔化，作為油相。另取月桂醇硫酸鈉24 g、甘油70 mL和純化水500 mL，加熱至同樣溫度，作為水相。將水相細(xì)流狀攪拌條件下加至油相，逐漸加量并研磨，至溫度降至 60 ℃時加入主藥，繼續(xù)研磨直至冷卻即得，批號：20180213)10 g，置50 mL燒杯，精密加入異丙醇10 mL，加入甲醇40 mL稀釋、超聲溶解提取20 min，放冷，用甲醇定容至刻度，孔徑0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣。

2.3專屬性實驗 取莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯混合對照品溶液適量，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，各組分理論塔板數(shù)均不低于3500；另準(zhǔn)確稱取空白乳膏，按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，精密吸取10 μL進(jìn)樣分析。樣品中各待測組分與相鄰峰分離度均大于1.5，輔料和提取液不干擾測定，該方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與線性范圍考察 精密吸取各對照品溶液適量，置量瓶，用甲醇逐級稀釋成莪術(shù)二酮為0.051～1.62 mg·mL-1、莪術(shù)醇為0.034～1.08 mg·mL-1、吉馬酮為0.033～1.04 mg·mL-1、β-欖香烯為0.081～2.60 mg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，將制得的4種待測物6個不同濃度混合對照品溶液，按色譜條件項下進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣3次取平均值，計算各對照品峰濃度，以濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1，各組分在其相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.998 9)。

表1 莪術(shù)油乳膏中4種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

2.5精密度實驗 取同一混合對照品溶液(莪術(shù)二酮0.101 mg·mL-1，莪術(shù)醇0.068 mg·mL-1，吉馬酮0.065 mg·mL-1，β-欖香烯0.162 mg·mL-1)，在上述色譜條件項下測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄4個對照品峰面積，并計算6次峰面積RSD。結(jié)果RSD分別為2.15%，1.99%，2.25%，1.87%，結(jié)果表明本實驗所用儀器精密度良好。

A.空白乳膏；B.4種待測物標(biāo)準(zhǔn)品；C.莪術(shù)油乳膏樣品；1.莪術(shù)二酮，2.莪術(shù)醇，3.吉馬酮，4.β-欖香烯。

2.6重復(fù)性實驗 取同一批莪術(shù)油乳膏樣品6份，每份10 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，測定4種待測物成分峰面積，外標(biāo)法計算濃度及其RSD?；衔镙g(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯RSD分別為1.07%，1.04%，1.19%，1.49%，結(jié)果表明本實驗提取測定方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實驗 取同一混合對照品溶液(莪術(shù)二酮0.101 mg·mL-1，莪術(shù)醇0.068 mg·mL-1，吉馬酮0.065 mg·mL-1，β-欖香烯0.162 mg·mL-1)，室溫放置，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣分析，分別在0，2，4，8，12 h進(jìn)樣10 μL，測定莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉瑪酮和β-欖香烯峰面積，RSD分別為0.85%，1.21%，0.91%和1.02%。結(jié)果表明4種待測成分的溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率實驗 取同一批莪術(shù)油乳膏(批號：20180213)6份，每份5 g，精密稱定，加入適量4種化合物標(biāo)準(zhǔn)品(相當(dāng)于樣品含量50%，100%，150%)到供試樣品，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積并通過外標(biāo)法計算濃度，計算各待測成分加樣回收率及RSD。結(jié)果見表2，顯示加入4種待測物成分樣品的平均加樣回收率為93.67%～98.73%，RSD<2.75%，表明本實驗方法準(zhǔn)確可靠。

表2 莪術(shù)油乳膏中4種成分加樣回收率實驗結(jié)果

2.9樣品含量測定 取3批莪術(shù)油乳膏樣品，每批3份，每份樣品取10 g，精密稱定，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，外標(biāo)法計算各批4種待測物含量，結(jié)果見表3。

表3 莪術(shù)油乳膏樣品含量測定結(jié)果

3 討論

莪術(shù)油乳膏作為一種透皮制劑，可以避免肝腸循環(huán)，還可直接作用于靶部位，直接給藥效果優(yōu)于口服或其他途徑。目前在國內(nèi)對含中藥材成分的乳膏劑尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但以乳化為基本操作工藝的產(chǎn)品必須按一定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測。筆者在本實驗采用高效液相色譜法測定莪術(shù)油乳膏含量，方法簡單、穩(wěn)定，重復(fù)性好，處方中基質(zhì)不干擾測定，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為建立莪術(shù)油乳膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。實驗中進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，由于本實驗待測4種酚酸類成分極性相近，為達(dá)到良好分離度。筆者在本實驗采用梯度洗脫，結(jié)合文獻(xiàn)考察不同流動相和檢測波長對樣品分離效果的影響，有機(jī)相采用甲醇-水、乙腈-水加入不同比例磷酸，分別組合挑選最優(yōu)流動相，經(jīng)過多次調(diào)整洗脫條件，最終確定以乙腈-水溶液系統(tǒng)作為流動相，4個活性成分得到較好地分離，且柱效較高，拖尾現(xiàn)象得到改善。

多年臨床試驗證實，中藥提取液含有揮發(fā)油成分的適宜做成乳膏，但乳膏中一些有效成分尚不明確，加上基質(zhì)影響，乳膏化學(xué)成分復(fù)雜，給質(zhì)量控制帶來難題。筆者在本實驗對莪術(shù)油乳膏提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以待測4個組分提取率為考察指標(biāo)，考查提取方法、提取溶劑、料液比等因素，因為莪術(shù)油有一定揮發(fā)性，所以不適合加熱提取，最終本實驗確定采用甲醇超聲提取方法，該方法準(zhǔn)確、簡單、重現(xiàn)性好。本實驗對莪術(shù)油乳膏中主要活性成分進(jìn)行了含量測定，除此之外，筆者還將對乳膏其他特性進(jìn)行測試，如外觀性狀、氣味、手感、pH值、黏度、皮膚刺激性、穩(wěn)定性評價實驗等。乳膏成分較復(fù)雜，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)手段分析有效成分在機(jī)體內(nèi)的吸收、分布以及代謝，闡釋作用機(jī)制，是以后研究的主要方向。