膳食纖維聯(lián)合美沙拉嗪治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效與機(jī)制

于沛，何賀，鈔艷惠，聶會(huì)娟

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450052)

炎癥性腸病是臨床常見腸道疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)[1-2]。UC發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，有研究表明其發(fā)病具有家族遺傳性[3]。臨床上UC治療難度較大，治療過程中易復(fù)發(fā)，表現(xiàn)為嚴(yán)重反復(fù)的腹瀉、便血和腹痛，患者體質(zhì)量持續(xù)下降[4]。患者生活質(zhì)量低下，身心備受折磨，并且長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)炎癥反應(yīng)會(huì)增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅患者生命安全[5]?；诖?，在現(xiàn)有臨床治療基礎(chǔ)上尋找更好的治療方案成為研究重點(diǎn)。美沙拉嗪(5-aminosalicylic acid，5-ASA)是臨床治療急性UC的首選藥物，具有良好的治療效果，但治療過程中復(fù)發(fā)率較高，臨床應(yīng)用受到限制[6-7]。近年來研究表明，UC發(fā)生與患者腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)[8-11]。腸道菌群穩(wěn)態(tài)對(duì)腸道健康至關(guān)重要，二者相互影響，密不可分。因此，維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)是治療UC的新途徑[12]。膳食纖維是良好的益生元，可以調(diào)控腸道菌群[13-16]。筆者在本研究比較膳食纖維聯(lián)合5-ASA和5-ASA治療UC的療效，并對(duì)其治療機(jī)制進(jìn)行初步探索，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS，美國(guó)MP公司，平均相對(duì)分子質(zhì)量36 000～50 000，批號(hào)：160110)，隱血試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：C027-1-1)；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A044-1-1)；羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，批號(hào)：170610)；5-ASA(上海愛的發(fā)制藥有限公司，批號(hào)：160306)；小鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及IL-10酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)分別為ml028611、ml00209、ml06315和ml037873)；燕麥、玉米、紅豆、花生和蓮子購于超市；動(dòng)物組織裂解液(上海生物工程有限公司，批號(hào)：C500028)；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄以及定量試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司TaKaRa(中國(guó))，批號(hào)分別為9767、RR036A、6396760]；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 BioTek Epoch 酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司，Epoch)，LXJ2I 型離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)，85-2型恒溫磁力攪拌機(jī)(上海斯樂儀器廠)，定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀(美國(guó)羅氏公司，Light Cycle-96)，電子分析天平E11140(德國(guó)梅特勒公司，感量：1 mg)，GZX-9023 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠)，NURO-5T自動(dòng)雙重純水蒸餾器(寧波科學(xué)儀器有限公司)，MiSeq高通量測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性6～8周齡無特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：NO.201615478，體質(zhì)量18～20 g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(蘇)2017-0007。小鼠飼養(yǎng)在光照12 h/黑暗12 h房間，溫度25 ℃，恒濕(相對(duì)濕度30%)。

1.4模型的建立 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由飲用3.5%DSS溶液(以純化水配制)7 d，建立急性UC模型，42只小鼠建模成功[17]。

1.5膳食纖維飼料的制備 稱取50 ℃烘干過夜的燕麥、玉米、紅豆、花生各100 g，蓮子30 g，粉碎成粉末，以料液比1：100加入純化水，50 ℃攪拌2 h，50 ℃烘干1 h，得含少量水分的糊狀混合成分。將糊狀混合成分裝入飼料模具定型，烘干后得膳食纖維飼料[18]。

1.6動(dòng)物分組與給藥 設(shè)未造模小鼠為正常對(duì)照組，將模型小鼠根據(jù)體質(zhì)量按完全隨機(jī)分組方法[19]分為模型對(duì)照組、5-ASA組和膳食纖維聯(lián)合5-ASA組(F-5-ASA組)。5-ASA組與F-5-ASA 組以5-ASA灌胃(5-ASA以0.5% CMC-Na配制成混懸液)，200 mg·kg-1；正常對(duì)照組與模型對(duì)照組灌胃相同劑量0.5% CMC-Na。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及5-ASA組給予正常飼料喂養(yǎng)7 d，F(xiàn)-5-ASA組給予膳食纖維飼料喂養(yǎng)7 d。

1.7檢測(cè)指標(biāo)與檢測(cè)方法 每天記錄小鼠體質(zhì)量、便血及腹瀉情況，并按文獻(xiàn)方法進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評(píng)分。末次給藥后處死，解剖，取回腸至肛門處結(jié)腸，測(cè)量長(zhǎng)度并攝相?？v向剪開結(jié)腸，取結(jié)腸內(nèi)容物置EP管，-80 ℃冰箱保存。剪取適當(dāng)長(zhǎng)度(約1.0 cm)，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。剩余組織立即置液氮保存。

1.8結(jié)腸組織炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)情況檢測(cè) 取液氮保存的結(jié)腸組織100 mg，置研缽，分3次加液氮，每次10 mL，快速充分研磨，加入組織裂解液1 mL，繼續(xù)研磨，直至無明顯塊狀組織。取液體500 μL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，冰浴超聲處理20～30 s，10 000 r·min-1離心10 min(r=8 cm)。取上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作流程，檢測(cè)結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α以及IL-10蛋白表達(dá)情況。

1.9小鼠腸道菌群的檢測(cè) 取-80 ℃冰箱凍存的小鼠結(jié)腸內(nèi)容物50 mg，每組小鼠樣本5只，進(jìn)行腸道菌群16 s RNA測(cè)序(金唯智生物科技有限公司，蘇州)。即采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGG-TWTCTAATCC ”序列的下游引物擴(kuò)增細(xì)菌V3和V4區(qū)，構(gòu)建測(cè)序文庫，使用Illumina MiSeq儀器進(jìn)行雙端測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states )預(yù)測(cè)菌群代謝途徑，采用STAMP軟件比較組間可視化差異菌群代謝途徑。

2 結(jié)果

2.1小鼠一般情況 見圖1。正常對(duì)照組小鼠體質(zhì)量無明顯變化；模型對(duì)照組、5-ASA組及F-5-ASA組小鼠從第5 天開始體質(zhì)量明顯下降，給予5-ASA或者F-5-ASA后小鼠體質(zhì)量緩慢上升。實(shí)驗(yàn)第14天，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，5-ASA組與F-5-ASA組體質(zhì)量明顯上升(P<0.01)。小鼠DAI評(píng)分見圖1B，正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)過程中DAI無明顯波動(dòng)，模型對(duì)照組呈逐漸上升趨勢(shì)，5-ASA組與F-5-ASA組先上升后逐漸下降。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組第14天DAI評(píng)分顯著增高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，5-ASA組與F-5-ASA組DAI評(píng)分較低。第14天各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度見圖1C、D。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸顯著縮短(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，5-ASA組與F-5-ASA組結(jié)腸明顯更長(zhǎng)(P<0.01)，提示5-ASA與F-5-ASA能有效緩解小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)。

2.2小鼠結(jié)腸切片形態(tài)學(xué) 見圖2。正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜完整，固有層黏膜下層及肌肉層分層明顯，結(jié)構(gòu)整齊清晰，隱窩排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織無明顯結(jié)構(gòu)層次，黏膜脫落，腺體和隱窩消失且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；5-ASA組與F-5-ASA組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)層次重構(gòu)，黏膜重塑，隱窩可見且有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。病理檢查結(jié)果表明，5-ASA與F-5-ASA對(duì)小鼠腸黏膜有良好保護(hù)作用，可改善腸黏膜損傷，減輕炎癥反應(yīng)。

2.3炎癥因子測(cè)定結(jié)果 見圖3。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸大量表達(dá)IL-1β、IL-6及TNF-α，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，5-ASA組IL-1β和TNF-α表達(dá)均下調(diào)；與模型對(duì)照組比較，5-F-ASA組上述3種促炎細(xì)胞因子表達(dá)均顯著下調(diào)。IL-10檢測(cè)結(jié)果見圖3D，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，5-ASA組和5-F-ASA組均顯著上調(diào)(均P<0.01)。上述結(jié)果表明，5-ASA與5-F-ASA對(duì)小鼠結(jié)腸炎癥具有治療作用，且5-F-ASA療效優(yōu)于5-ASA。

①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.5-ASA組；D.F-5-ASA組。

①與正常對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

2.4小鼠腸道菌群多樣性測(cè)定結(jié)果 由圖4A可知，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠腸道菌群多樣性降低；與模型對(duì)照組比較，5-ASA組與F-5-ASA組腸道菌群多樣性增加，表明5-ASA和F-5-ASA對(duì)小鼠腸道菌群有調(diào)控作用。由圖4B PCoA分析可知，主成分Axis.1和Axis.2之和達(dá)到64.7%，4組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明4組小鼠腸道菌群組成有明顯差異。

圖4 4組小鼠腸道菌群測(cè)定的α 和 β多樣性

2.5小鼠腸道菌群豐度測(cè)定結(jié)果 由圖5A-D可知，在門分類水平上，正常對(duì)照組、5-ASA組及F-5-ASA組主要以擬桿菌門(bacteroidetes)為主，相對(duì)豐度分別為47.0%，45.0%和49.0%；其次是厚壁菌門(firmicutes)，分別為35.0%，31.0%和26.0%；模型對(duì)照組主要以厚壁菌門為主(相對(duì)豐度51.0%)，其次是擬桿菌門(相對(duì)豐度31.0%)。表明5-ASA與F-5-ASA能夠改善由DSS所致腸道菌群紊亂。圖5E-F顯示在屬水平上各組小鼠菌群分布差異情況。4組小鼠腸道菌群豐度差異可從LEFse分析看出，模型對(duì)照組與其他3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LDA>2)的菌屬有5種，分別是Oscillospira、Odoribacter、Dorea、Lactobacillus和Coprococcus。5-ASA組有3種，分別為MUcispirillum、Butrricimonas和Pseudomonas。F-5-ASA組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌屬有9種，其中差異最大的屬是Bacteroides，其次是Parabacteroides、Campylobacter、Helicobacter和Eubacterium等。

2.6小鼠腸道菌群代謝功能 見圖6。通過與Clusters of Orthologs Groups (COG) 數(shù)據(jù)庫比對(duì)，DSS處理小鼠后共有25種代謝途徑顯著改變。其中腸阿米巴病(amoebiasis)代謝、氨基酸代謝(amino acid metabolism)及脂肪酸代謝(fatty acid metabolism)途徑被顯著上調(diào)，而包括硫胺素代謝(thiamine metabo-lism)、原發(fā)性免疫缺陷(primary immunodeficiency)和半乳糖代謝(galactose metabolism)在內(nèi)的22種代謝途徑被顯著抑制(圖6A)。與模型對(duì)照組比較，5-ASA組12種代謝途徑顯著改變。其中硫胺素代謝(thiamine metabolism)，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis)，碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)，氮代謝(nitrogen metabolism)以及限制酶(restriction enzyme)代謝途徑被顯著下調(diào)，丁酸代謝(butanoate metabolism)、丙酸代謝(propanoate metabolism)、氯代烷烴和氯代烯烴降解(chloroalkane and chloroalkene degradation)、醚脂代謝(ether lipid metabolism)、RIG-I樣受體信號(hào)通路(RIG-I-like receptor signaling pathway)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)和萘降解(naphthalene degradation)代謝途徑顯著上調(diào)(圖6B)，表明5-ASA可提高小鼠腸道內(nèi)細(xì)菌功能。F-5-ASA組小鼠腸道細(xì)菌功能有極大改變(圖6C)。由圖6可知，與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)-5-ASA組有45種代謝途徑被顯著改變，其中22種上調(diào)，23種下調(diào)。上調(diào)代謝途徑包括碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine，tyrosine and

tryptophan biosynthesis)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)等，下調(diào)途徑包括丙酸代謝(propanoate metabolism)、細(xì)菌趨化性(bacterial chemotaxis)和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)蛋白(bacterial motility proteins)等代謝途徑(圖6C)。

A.正常對(duì)照組門分類水平相對(duì)豐度；B.模型對(duì)照組門分類水平相對(duì)豐度；C.5-ASA組門分類水平相對(duì)豐度；D.F-5-ASA組門分類水平相對(duì)豐度；E.屬分類水平菌群豐度熱圖；F.LEfSe分析中顯示的各組差異菌屬。

3 討論

UC常年反復(fù)發(fā)作，極大地影響患者生活質(zhì)量，威脅患者生命。5-ASA是已經(jīng)上市的急性UC治療藥物，其主要藥理作用機(jī)制為抑制前列腺素及白三烯生物合成?？诜?-ASA可有效緩解炎癥，改善臨床癥狀，短期治療可以達(dá)到良好效果，但遠(yuǎn)期治療易復(fù)發(fā)，效果不佳。

以DSS建立UC模型由日本學(xué)者于1985年提出，小鼠在自由飲用一定濃度DSS后會(huì)自發(fā)出現(xiàn)腸炎，此種腸炎病理學(xué)表現(xiàn)與臨床UC患者相似，在研究UC發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。筆者在本研究中采用3.5%DSS造模，小鼠自由飲用4 d后出現(xiàn)明顯體質(zhì)量減輕、便血和腹瀉癥狀，14 d后病理切片顯示結(jié)腸部位炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，結(jié)腸組織完整結(jié)構(gòu)破損，提示模型建立成功。

在盲腸和結(jié)腸，腸道菌群代謝產(chǎn)物是腸黏膜上皮細(xì)胞主要能量和營(yíng)養(yǎng)來源。研究表明，腸道微生物在維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。短鏈脂肪酸(如乙酸、丙酸和丁酸)是腸道微生物發(fā)酵食物中難消化的碳水化合物產(chǎn)生的小分子化合物。短鏈脂肪酸被小腸上皮細(xì)胞吸收，通過以下途徑發(fā)揮抗炎作用：①為腸上皮細(xì)胞提供直接能量；②激活上皮細(xì)胞G蛋白耦聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs，主要有GPR41、GPR43和GPR109A)；③抑制組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)活性，從而調(diào)控基因表達(dá)。IBD 中短鏈脂肪酸顯著降低，可能是影響內(nèi)部和免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素。研究表明，臨床UC患者糞便腸道菌群表現(xiàn)為多樣性降低，有益菌群豐度減少或消失，有害菌群大量繁殖[10]。機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，有害菌群代謝物(如脂多糖)會(huì)損傷腸道黏膜，使腸道免疫系統(tǒng)紊亂，加劇炎癥進(jìn)程。研究表明，調(diào)控炎癥所致腸道菌群紊亂是治療UC的新思路新方法。膳食纖維已被大量研究證明對(duì)腸道菌群具有良好調(diào)控作用。ZHAO等[20]研究表明，將燕麥、玉米、紅豆、薏米、蕎麥、山藥、花生和蓮子做成復(fù)合膳食，2型糖尿患者使用3個(gè)月，能夠通過調(diào)控患者失衡的腸道菌群，從而極大改善患者臨床癥狀。

A.正常對(duì)照組與模型對(duì)照組比較；B.模型對(duì)照組與5-ASA組比較；C.模型對(duì)照組與F-5-ASA組比較。

本研究中，筆者選擇燕麥、玉米、紅豆、花生和蓮子制備膳食，飼喂腸炎小鼠7 d，同時(shí)給予5-ASA治療7 d。結(jié)果表明，F(xiàn)-5-ASA組小鼠治療后體質(zhì)量、DAI以及結(jié)腸長(zhǎng)度均明顯低于模型對(duì)照組，且效果優(yōu)于5-ASA組。病理切片和結(jié)腸組織炎癥因子檢測(cè)表明，F(xiàn)-5-ASA組小鼠腸黏膜再生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，IL-1β、IL-6及TNF-α促炎細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，抑炎細(xì)胞因子IL-10顯著上調(diào)。以上結(jié)果說明，膳食纖維聯(lián)合5-ASA治療具有協(xié)同效果，可在5-ASA治療基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升腸道黏膜屏障修復(fù)能力，調(diào)控細(xì)胞因子釋放分泌，從而提升治療效果。為評(píng)估膳食對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)控效果，筆者在本研究中對(duì)小鼠腸道菌群豐度和代謝途徑進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明膳食纖維聯(lián)合5-ASA治療可改善小鼠腸道菌群多樣性，調(diào)控特定腸道菌群在門和屬水平豐度，并顯著改變特征菌群代謝途徑。

綜上所述，膳食纖維聯(lián)合5-ASA治療UC可通過調(diào)控小鼠腸道菌群和改變菌群代謝途徑，有效改善腸道炎癥癥狀，調(diào)控炎性細(xì)胞因子分泌，達(dá)到良好的治療效果。