基于腫瘤教化血小板的液體活檢研究進展*

文霄瑕 楊桂姝 祖瑞鈴 張開炯 廖鈺霖 李石 余思思 王東生 冷平 綜述 羅懷超 審校

惡性腫瘤嚴重危害全人類生命健康，根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）的預估，在172 個國家中，癌癥是其中91 個國家70 歲以下人群的第一或第二大死因[1]。根據(jù)臨床專家權威共識，早期篩查對癌癥診斷和治療具有重要意義，甚至能有效降低癌癥死亡率[2]。近年來，液體活檢因其可連續(xù)取樣、自動化完成以及結果可重復等優(yōu)勢被認為是癌癥早期檢測和癌癥病程中的無創(chuàng)性腫瘤分析和監(jiān)測的重要工具[3]。其中研究較多的有ctDNA、CTCs、EVs 和TEPs等[4-5]，上述生物分子通常被認為是原發(fā)性腫瘤的腫瘤發(fā)生和發(fā)展的一部分。如CTCs 中包含著關于腫瘤形成及轉(zhuǎn)移、藥物敏感性和耐藥性等遺傳學信息[6]，而腫瘤患者血液中ctDNA 的致癌基因突變往往可以早于影像學診斷。因此，CTCs 及ctDNA 水平有助于研究早期腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及進展，并監(jiān)測治療的效果[7]。此外，近年來大量研究表明，TEPs 可促進腫瘤侵襲、遷徙和增殖，是腫瘤生長的全身和局部反應的核心參與者[8-9]，盡管目前關于TEPs 形成機制尚未明確，但是相比于血液中其他生物分子，TEPs 含量豐富、容易分離、RNA 質(zhì)量相對更高以及其響應外部信號處理RNA 的能力都更具優(yōu)勢[10]，使其在液體活檢中有著良好的應用前景（圖1）。

1 腫瘤教化血小板

血小板是從人體骨髓中產(chǎn)生的循環(huán)外周血細胞，數(shù)量僅次于外周紅細胞，因其在止血和傷口愈合中的重要作用而被認識。但是血小板一直是潛在癌癥診斷工具，簡單的血小板計數(shù)、血小板大小等就包含了大量臨床信息[11]。有研究通過分析富含血小板的血漿（platelet rich plasma，PRP）中的血小板參數(shù)，發(fā)現(xiàn)與正常個體相比，肺癌患者PRP 中的血小板平均體積（mean platelet volume，MPV）、血小板計數(shù)和血小板回收率（percentage platelet recovery，PPR）均存在顯著性差異[12]。血小板雖然是無核細胞，但其含有豐富的RNA，包括信使RNA（messenger RNA，mRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、核仁小分子RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、微小核糖核酸（microRNA，miRNA）等[10，13]。其中miRNA 所占比例最多，并且在血小板中發(fā)揮剪接和轉(zhuǎn)錄、調(diào)控誘導蛋白質(zhì)重組以及抑制血小板蛋白的表達等重要作用[14]。在血小板與腫瘤相互作用的病理生理過程中，腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境能夠通過不同信號分子間接或通過不同受體（如血小板活化受體P 選擇素）直接與血小板相互作用，從而改變血小板的RNA 信息及蛋白質(zhì)含量[15-16]，這種因腫瘤影響導致RNA 譜發(fā)生改變的血小板稱為腫瘤教化血小板（tumor-educated platelets，TEPs），見圖1。盡管目前導致TEPs 的RNA 譜表達發(fā)生改變的生物學機制尚缺乏準確的定義，但是研究表明在腫瘤患者體內(nèi)，TEPs 的 RNA 譜表達受到病理生理條件的動態(tài)影響[17]，并且TEPs 能促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，包被CTC 使其逃避免疫機制[18]。由此可見TEPs 可作為加強腫瘤早期診斷，并促進非侵入性腫瘤監(jiān)測前景的良好生物標志物。

圖1 腫瘤教化血小板（TEPs）的形成途徑以及基于TEPs 的液體活檢的應用研究進展

2 基于TEPs 液體活檢的應用

2.1 TEPS 可實現(xiàn)基于血液的腫瘤診斷

采集的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝全血（室溫儲存＜48 h）進行120 g 離心20 min 后獲得PRP，再對PRP 進行360 g離心20 min 獲得下層的濃縮血小板，測定血小板純度在每1 000 萬血小板中有核細胞＜5 個，提取血小板RNA 后通過測序手段定性定量分析血小板在特定狀態(tài)下的RNA 組成與含量信息，從而產(chǎn)生血小板的RNA 譜[10，16-17]。

Calverley 等[19]通過微陣列分析比較7 例健康供體和5 例從未治療的轉(zhuǎn)移性肺癌患者的血小板RNA 譜，發(fā)現(xiàn)200 個基因有顯著改變，其中197 個基因低表達，表明轉(zhuǎn)移性肺癌患者TEPs RNA 譜與健康成人有顯著區(qū)別，利用TEPs 可實現(xiàn)對轉(zhuǎn)移性肺癌的預測。這項研究為后續(xù)基于TEPs RNA 進行癌癥診斷奠定了基礎。2015年，Best 團隊對55 例健康供體和228 例局部以及轉(zhuǎn)移癌癥患者，包括非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、結腸癌（colorectal cancer，CRC）、膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）、胰腺癌（pancreatic cancer，PAAD）、肝及膽管癌（hepatobiliary cancer，HBC）和乳腺癌（breast cancer，BrCa）血小板進行廣泛的RNA 測序，發(fā)現(xiàn)了癌癥患者的TEPs 中存在5 003 個不同表達的蛋白質(zhì)編碼和非編碼RNA，通過對這些RNA 進行已知的血小板標記物的鑒定，結果顯示有1 453 個mRNAs 高表達，793 個mRNAs 低表達。根據(jù)這些差異RNA 開發(fā)了一種算法鑒別癌癥患者與正常人群，準確率可達到96%[17]。

2017年，Best 團隊再次應用 TEPs 對NSCLC 進行了后續(xù)更深入研究，納入了不同分期的NSCLC 患者，還包含了對年齡、吸煙習慣、炎癥狀態(tài)的分析，并將血小板分離時間標準化以及利用粒子群優(yōu)化（particle swarm optimazation，PSO）增強算法從血小板RNA 測序文庫中選擇了最佳的TEPs RNA 生物標志物集，通過TEPs RNA 譜的差異將245 例Ⅳ期晚期NSCLC 患者和273 例健康受試者正確區(qū)分，準確率為89%，將53 例Ⅰ～Ⅲ期的NSCLC 患者和53 例健康受試者正確區(qū)分，準確率為 81%。其準確性隨樣本量增加而提高且不受個體的年齡、吸煙習慣、全血儲存時間和各種炎癥的影響[20]。這些結果證實TEPs不僅可以診斷肺癌還可以區(qū)分不同分期的肺癌。近期, 有研究對7 例健康個體和15 例NSCLC 患者的血小板同樣進行了RNA-seq 檢測，同時增加對NSCLC亞組進行轉(zhuǎn)錄比較分析，結果顯示肺腺癌和肺鱗狀細胞癌亞組的TEPs RNA 譜也存在的顯著性差異[21]，通過TEPs RNA 譜的差異可以將肺腺癌和肺鱗狀細胞癌區(qū)分，表明利用TEPs RNA 譜的改變診斷不同病理類型的肺癌具有一定前景。由于大部分肺癌早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，患者往往錯失最佳治療時機，導致肺癌成為全世界癌癥相關死亡的主要原因[12]。近年來，利用基于TEPs 的液體活檢對肺癌進行早期診斷以及分型診斷的研究發(fā)展迅速，開展的臨床研究也不斷取得可喜的成果，為肺癌早期診斷及減少死亡率提供了更多方案。

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌。目前，主要診斷方式為結腸鏡檢測，但是使用結腸鏡檢查成本高，容易引起腸道不適以及并發(fā)癥[22]，因此血液標志物用于結腸癌檢測更容易被患者接受。自Best 等[17]研究發(fā)現(xiàn)利用TEPsRNA 譜可實現(xiàn)區(qū)分健康供者和癌癥患者從而可以對多種癌癥診斷提供更無創(chuàng)安全的方案后，Yang 等[22]通過進一步分析44 例結直腸癌患者和55 例健康成人發(fā)現(xiàn)，結腸患者TEPsRNA 中1 099 個不同的血小板表達基因（differentially expressed genes，DEGS），包括824 個高表達的DEGS 和275 個低表達的DEGS，使用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測后顯示來自結腸癌患者血小板中的金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）水平顯著高于健康個體、潰瘍性結腸炎患者和克羅恩病患者，再次驗證了通過結腸癌患者TEPsRNA 譜表達改變對結腸癌進行診斷的可行性，推動了利用基于TEPs 的液體活檢對診斷結腸癌的研究進展。

除此之外，利用TEPs RNA 譜在肉瘤診斷中也取得一定進展。一項研究通過對57 例活動性肉瘤患者、38 例3年內(nèi)無復發(fā)的曾患肉瘤的患者和65 例健康成人的TEPs RNA 譜進行分析比較，結果顯示活動性肉瘤患者的TEPs RNA 譜中有2 537 個RNA 發(fā)生顯著改變，利用TEPsRNA 譜的不同既可區(qū)分健康成人，也可區(qū)分已經(jīng)恢復并且無復發(fā)的肉瘤患者[23]。肉瘤是起源于間葉組織（包括結締組織和肌肉）的惡性腫瘤，復發(fā)率高，目前尚未發(fā)現(xiàn)血液中的生物標志物可用于肉瘤的早期診斷。盡管該項利用TEPs RNA 進行肉瘤診斷的研究樣本量較小，但是可以發(fā)現(xiàn)TEPs 作為肉瘤早期診斷的新型血液生物標志物的巨大潛力，而基于TEPs 的液體活檢方式也有望成為肉瘤早期診斷的輔助方式。

基于TEPs RNA 譜的改變對乳腺癌的診斷具有一定潛力，利用替代TEPs RNA 譜可實現(xiàn)區(qū)分HER-2、PIK3CA 突變體或三陰性乳腺癌[17]。Yao 等[24]開展了更大規(guī)模的研究，對549 例未經(jīng)任何治療的BrCa 患者和154 例年齡匹配的健康志愿者的血小板RNA 進行高通量測序qRT-PCR，并對基因表達特征進行了表征。在BrCa 患者和健康志愿者之間共鑒定了138 個上調(diào)基因mRNAs 和18 個下調(diào)基因mRNAs，證實通過TEPsRNA 譜的改變可以實現(xiàn)區(qū)分乳腺癌患者和健康志愿者。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在國內(nèi)發(fā)病率僅次于宮頸癌。上述研究結果為利用TEPs 進行乳腺癌的早期診斷研究提供了更有力的依據(jù)。

2.2 基于TEPs 液體活檢在癌癥監(jiān)測中的應用

近年來，隨著對基于TEPs 的液體活檢更為深入的研究，發(fā)現(xiàn)利用TEPs 不僅可以診斷癌癥發(fā)生，在癌癥發(fā)展監(jiān)測也有一定發(fā)展前景。Nillson 等[25]在NSCLC 患者的TEPs 分離的腫瘤來源RNA 分子中檢測出促使肺腺癌發(fā)生發(fā)展的EML4-ALK 融合基因，準確率為86%，對NSCLC 患者進行抗EML4-ALK藥物克唑替尼治療后，再次檢測結果顯示出循環(huán)TEPs 中EML4-ALK 融合基因的數(shù)量減少，正常血小板生命周期僅7～10 天，腫瘤的轉(zhuǎn)錄組可以在TEPs中積累，并且不受循環(huán)血漿中RNA 的干擾。因此，TEPs RNA 分析可揭示肺癌活動的最新、增強和動態(tài)反映。利用成像模式監(jiān)測治療反應，假陽性腫瘤進展仍然是一個無法避免的難題，但是Sol 等[26]的研究通過使用TEPs RNA 特征，可有效區(qū)分假陽性的腦膠質(zhì)瘤患者和真正腦膠質(zhì)瘤進展的患者。Yang 等[22]研究中提到TEPs 中的TIMP1 在血小板與結腸癌細胞相互作用過程中能夠被攜帶進入到結直腸癌細胞中，從而促進結直腸癌增殖發(fā)展。利用基于TEPs 的液體活檢技術不僅可以實現(xiàn)對結直腸癌的早期診斷，還可以將TEPs RNA 中的TIMP1 作為結直腸癌不同發(fā)展階段的潛在標志物監(jiān)測結直腸癌的活動與病程發(fā)展。此外，研究顯示BrCa 患者TEPs 中肌球蛋白3（TPM3）mRNA 的表達明顯升高，并且可通過微囊泡被傳遞到BrCa 細胞中導致BrCa 細胞遷移表型增強，與BrCa早期轉(zhuǎn)移顯著相關[24]。局限性BrCa 的女性5年相對生存率為99%，而轉(zhuǎn)移的患者則下降至7%，根據(jù)TEPs 中TPM3 mRNA 的表達水平來監(jiān)測乳腺癌是否有轉(zhuǎn)移，有效降低了女性因未及時監(jiān)測到乳腺癌轉(zhuǎn)移從而引發(fā)死亡的概率。

3 結語與展望

隨著近年來分子生物學檢測技術的不斷發(fā)展，關于液體活檢的研究也顯著增加，使液體活檢技術取得快速發(fā)展。液體活檢作為精準醫(yī)療的新技術在腫瘤發(fā)生檢測以及腫瘤發(fā)展監(jiān)測及預后評估中具有獨特的技術優(yōu)勢和廣泛的臨床應用價值。利用TEPs 開展癌癥的檢測與監(jiān)測的各種研究，擴充了液體活檢的途徑，使基于TEPs 的液體活檢越來越受到各方認可。但是目前基于TEPs 的液體活檢的臨床研究依舊具有一定局限性，包括樣本量小、試驗條件不夠標準化等，未來的臨床驗證研究需要在大樣本的隊列中進行，并且應將樣本采集流程及儲存條件標準化以及將腫瘤患者及健康供者可能影響研究結果準確性的潛在變量（年齡、性別、生活習慣等）相匹配后再進行對比，最終確認基于TEPs 的液體活檢的臨床應用價值。另外，未來研究也應注重闡明TEPs 對腫瘤發(fā)生發(fā)展的相互作用機制，為基于TEPs 的液體活檢研究帶來希望。