甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3b和SPG20甲基化在肺腺癌中的相關性研究*

趙寶山 邢志君 孫光蕊 張志民 張旭 梁宗英

原發(fā)性肺癌是我國發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，嚴重影響了居民生命健康[1-2]。早發(fā)現(xiàn)、早治療是降低肺癌病死率的關鍵[3]。傳統(tǒng)觀念認為癌癥的發(fā)生和發(fā)展主要依賴于腫瘤相關基因序列的改變，但現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關基因DNA 甲基化等表觀遺傳變化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中部分基因甲基化變化影響基因表達，最終影響肺腺癌患者的預后[5-6]。SPG20 甲基化是肺腺癌患者腫瘤組織內(nèi)特異性標志物，其甲基化水平隨著病程進展而不斷升高，但SPG20 基因甲基化診斷肺腺癌病變的敏感度相對較低。因此，探討肺腺癌SPG20 基因甲基化狀態(tài)及前期分子事件至關重要。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3b（DNA methyltransferase 3b, DNMT3b）是DNMTs的重要成員，可促進全基因組的整體甲基化[7]，但DNMT3b 在不同腫瘤中對不同的基因甲基化作用并不一致。本研究旨在通過檢測肺腺癌組織和癌旁組織中SPG20 基因的甲基化水平、SPG20 和DNMT3b的表達，分析肺腺癌進程中DNMT3b 表達與SPG20基因甲基化的相關性，探討肺腺癌的發(fā)病機制，為診療提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本和細胞 選取自2020年4月至2021年4月于承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院經(jīng)術(shù)后診斷為肺腺癌患者的組織標本70 例，試驗組為70 例肺腺癌組織，對照組為70 例癌旁組織（距癌組織＞6 cm）。其中男性27 例，女性43 例；年齡＜60 歲28 例，年齡≥60 歲42例；TNM 分期Ⅰ期33 例，Ⅱ期21 例，Ⅲ期16 例；高分化6 例，中分化51 例，低分化13 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57 例。納入研究的患者均無其他腫瘤病史，手術(shù)前均無放化療、免疫及靶向治療史。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，并獲得患者知情同意。

1.1.2 試劑和儀器 甲基化修飾試劑盒購于德國QIAGEN 公司，焦磷酸測序試劑購于美國CST 公司，DNA 提取試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，RNA 干擾序列由廣州銳博生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 焦磷酸測序檢測SPG20 基因甲基化 使用組織或細胞DNA 提取試劑盒提取組織標本的總DNA，采用ED DNA 甲基化試劑盒對提取的DNA 進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。SPG20 基因甲基化擴增正向引物序列為5′-AGGAAGTATGAAAGAATGTATTGTAAAG-3′，反向引物序列為5′-CCCCTCAAAATTAAACAACCT TTCTCTACA-3′。將擴增產(chǎn)物送深圳華大基因股份有限公司進行焦磷酸測序，采用PyroQ-CpG 軟件自動分析每個位點的甲基化狀態(tài)，計算甲基化率。

1.2.2 免疫組織化學法 將組織蠟塊4 μm 切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精浸泡，滴加3%H2O2，室溫放置10 min。破膜后，將切片放入檸檬酸緩沖液，置于微波爐中高溫修復抗原12 min。切片自然冷卻后，滴加山羊血清，室溫放置20 min 進行封閉。清洗后，在濕盒中一抗（兔抗人DNMT3b 單克隆抗體為1:1 000；兔抗人SPG20 單克隆抗體為1:1 000）孵育4℃過夜。室溫條件下，二抗（山羊抗兔）孵育30 min。DAB 顯色，蘇木素復染細胞核。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測SPG20 和DNMT3b mRNA 的表達 RNA 提取試劑盒提取組織和細胞總RNA。取300 ng RNA，使用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書進行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green qPCR Master 熒光定量試劑盒檢測SPG20 和DNMT3b mRNA 的表達，各引序列見表1。相對表達量為2-ΔΔCt。

表1 各基因的實時熒光定量聚合酶鏈反應引物序列

1.2.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用脂質(zhì)體介導法，將DNMT3b siRNA 和陰性對照siRNA 分別轉(zhuǎn)染A549 細胞株。實驗重復3 次。

1.3.5 Western blot 法檢測組織及細胞內(nèi)蛋白表達 提取組織或細胞內(nèi)總蛋白并進行蛋白濃度測定。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，并采用半干轉(zhuǎn)膜法將總蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h 后，將膜放入稀釋好的一抗中孵育40 min。漂洗后，將膜放入稀釋好的二抗中孵育30 min。漂洗后，暗室中進行發(fā)光反應，并曝光至X-ray 膠片。采用Image Pro Plus 軟件分析蛋白條帶的積分光密度IOD 值，以目的蛋白的IOD 值和內(nèi)參的IOD 值的比值反映各組目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料資料符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)采用x±s表示；計數(shù)資料采用χ2分析，配對樣本采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌和癌旁組織中SPG20 甲基化水平

SPG20 基因在癌組織中甲基化率為76.25%±5.74%，顯著高于癌旁組織13.45%±2.41%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 肺腺癌和癌旁組織中SPG20 甲基化水平

2.2 肺腺癌和癌旁組織中SPG20 和DNMT3b mRNA相對表達量

RT-qPCR 結(jié)果顯示，SPG20 mRNA 相對表達量在癌組織中為0.18±0.03，低于癌旁組織的1.21±0.17，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。DNMT3b mRNA 相對表達量為1.62±0.27，高于癌旁組織的0.32±0.05，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 肺腺癌和癌旁組織中SPG20 和DNMT3b mRNA 相對表達量

2.3 肺腺癌和癌旁組織中SPG20 和DNMT3b 蛋白表達量

免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，癌組織和癌旁組織中SPG20 蛋白陽性表達率為27.14%（19/70）和72.86%（51/70），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。癌組織和癌旁組織中DNMT3b 蛋白陽性表達率為75.71%（53/70）和22.86%（16/70），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 肺腺癌和癌旁組織中DNMT3b 和SPG20 蛋白表達（SP ×200）

2.4 肺腺癌和癌旁組織中SPG20 和DNMT3b 蛋白表達量

Western blot 檢測結(jié)果顯示，DNMT3b 在癌組織中表達為68.57%±3.18%，高于癌旁組織25.29%±1.35%；SPG20 在癌組織中表達為16.87%±1.56%，低于癌旁組織58.75%±2.68%，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05，圖4）。

圖4 肺腺癌和癌旁組織中DNMT3b 和SPG20 蛋白表達

2.5 肺腺癌組織中SPG20 甲基化和DNMT3b 的相關性

SPG20 甲基化和DNMT3b 表達呈正相關（r=0.437，P＜0.05，表2）。

表2 癌組織中SPG20甲基化與DNMT3b表達的相關性（例）

2.6 肺腺癌組織中SPG20 甲基化及DNMT3b 與臨床病理特征的相關性

SPG20 甲基化與肺腺癌TNM 分期、組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關（P＜0.05），與性別和年齡無關（P＞0.05）。DNMT3b 陽性表達與TNM 分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關（P＜0.05），與性別和年齡無相關性（P＞0.05）。見表3。

表3 肺腺癌組織中SPG20 甲基化、DNMT3b 與臨床病例特點的關系（n，%）

2.7 RNA 干擾下調(diào)DNMT3b后A549細胞中DNMT3b和SPG20 的表達

RT-qPCR 和Wesrern blot 結(jié)果顯示，DNMT3b si-RNA、陰性對照和空白對照組中，以DNMT3b si-RNA 組中DNMT3b mRNA 和蛋白表達最低，而陰性對照和空白對照組DNMT3b mRNA 和蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，表明DNMT3b si-RNA 在A549 細胞中干擾成功（圖5～7）。DNMT3b si-RNA 組中SPG20的mRNA 和蛋白表達最高，明顯高于陰性對照和空白對照組，而陰性對照和空白對照組二者之間差異無統(tǒng)計學意義（圖8，9）。

圖5 RNA 干擾DNMT3b 轉(zhuǎn)染A549 細胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果

圖6 RNA 干擾DNMT3b 轉(zhuǎn)染A549 細胞后DNMT3b mRNA 相對表達量

圖7 RNA 干擾DNMT3b 轉(zhuǎn)染A549 細胞后DNMT3b 蛋白表達量

圖8 RNA 干擾DNMT3b 轉(zhuǎn)染A549 細胞后SPG20mRNA 相對表達量

圖9 RNA 干擾DNMT3b 轉(zhuǎn)染A549 細胞后SPG20 蛋白表達量

2.8 Si-RNA 干擾DNMT3b 對肺腺癌A549 細胞SPG20 甲基化的影響

焦磷酸測序檢測結(jié)果顯示，DNMT3b si-RNA 組SPG20 甲基化水平最低，而陰性對照和空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示抑制DNMT3b 的表達可以明顯降低A549 細胞中SPG20 甲基化水平（表4）。

表4 干擾DNMT3b 后各實驗組細胞內(nèi)SPG20 甲基化率（%）

3 討論

肺癌是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病年齡的年輕化趨勢愈加明顯[8]。肺癌具有發(fā)現(xiàn)晚、轉(zhuǎn)移早、病死率高的特點，致使其患者的總體預后不佳[9-10]。研究表明，肺癌的發(fā)生是多個基因和多種因素共同參與導致的結(jié)果[11]。目前肺腺癌已經(jīng)成為肺癌多種病理類型中最常見的一種，約占全部肺癌發(fā)病率一半以上。因此，提高肺腺癌的早期診斷率、發(fā)現(xiàn)評估預后的新指標和抗腫瘤治療的新靶點是肺癌防治工作的重點[12-13]。

研究顯示，表觀遺傳甲基化修飾參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[14]。DNA 甲基化修飾的紊亂狀態(tài)幾乎存在于所有的腫瘤細胞內(nèi)。細胞內(nèi)異常的甲基化會導致機體基因表達異常，導致腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和惡化[15-17]。SPG20 基因編碼Spartin 多功能蛋白，參與人體多種疾病的發(fā)生。SPG20 在細胞分裂周期的異常作用與腫瘤的發(fā)生具有相關性；SPG20 啟動子甲基化在肝癌和胃癌中的作用已經(jīng)被證實，并作為腫瘤發(fā)展的早期事件[18-19]。本課題組前期的研究結(jié)果表明，SPG20 基因在肺腺癌組織內(nèi)呈高甲基化狀態(tài)，且與肺癌TNM病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。本研究再次通過檢測肺腺癌樣本，進一步證實SPG20 基因在癌組織中發(fā)生甲基化，且其甲基化率明顯高于癌旁組織。肺腺癌組織中SPG20 的高甲基化狀態(tài)與腫瘤的TNM 分期、分化以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移具有相關性，說明SPG20 基因的高甲基化與肺腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移具有一定的相關性，而癌組織中SPG20 mRNA 的表達水平明顯低于癌旁組織，提示作為抑癌基因的SPG20 可能因發(fā)生甲基化而抑制SPG20 基因的轉(zhuǎn)錄，進而導致了蛋白的低表達。推測其可能因SPG20 高甲基化狀態(tài)使其基因表達抑制或缺失，進而導致Spartin 蛋白減少或缺失，從而促進了肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

甲基化修飾需要DNMTs 的參與，DNMTs 的動態(tài)變化而使得DNA 的高甲基化和低甲基化之間處于互相可逆的動態(tài)過程[20]。研究證實，在乳腺癌、前列腺癌及肝癌中已經(jīng)成功通過外源性甲基供體SAM 高甲基化關鍵癌基因DNA[21-23]，實現(xiàn)了抑制癌基因的過表達，進而抑制腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。同時，外源性SAM 也具有直接抑制去甲基化酶的作用，提高細胞DNA 甲基化水平。研究發(fā)現(xiàn)，DNMTs 表達與結(jié)直腸癌甲基化異常有關，參與了結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。DNMT3b 是DNMTs 家族中重要的一員，可促進整體基因組甲基化，參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[24]。DNMT3b 通過促進SETP9 甲基化促進肝星形細胞的活化和肝纖維化的發(fā)生[25]。本研究通過檢測肺腺癌組織和癌旁組織中mRNA 和蛋白表達，證實癌組織中DNMT3b mRNA 和蛋白的表達均明顯高于癌旁組織，且其癌組織中的陽性表達與肺腺癌的TNM 分期、腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。隨著腫瘤分期的增加、腫瘤分化的降低，DNMT3b 蛋白的表達量逐漸上升，腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的表達明顯升高，提示其可能促進肺腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，進而使得肺腺癌的惡性程度增強，導致其容易通過淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移。

研究證實，下調(diào)或沉默DNMTs 的表達可以使腫瘤細胞的整體基因組甲基化率下降。聯(lián)合降低多種DNMTs 可使腫瘤細胞的整體基因甲基化率明顯下降[26]，沉默DNMT3b 有可能發(fā)揮更高的去甲基化及抑制腫瘤細胞的作用。有研究證實，抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達后，不同的基因在不同的腫瘤細胞中去甲基化水平亦不相同[27]，提示DNMT3b 在不同腫瘤中對不同基因甲基化的調(diào)控結(jié)局并不一致。但在肺腺癌中，DNMT3b 作為甲基化轉(zhuǎn)移酶是否參與SPG20 高甲基化的關系尚不明確。本研究通過分析DNMT3b 和SPG20 甲基化水平相關性顯示，在肺腺癌組織中SPG20 高甲基化與DNMT3b 的陽性表達呈正相關，提示DNMT3b 作為DNMTs 可能參與了SPG20 基因的甲基化，促進了肺腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。進一步通過體外細胞實驗驗證甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3b 與SPG20 甲基化的相關性。結(jié)果顯示，RNA 干擾下調(diào)DNMT3b 后SPG20 基因甲基化率明顯降低，SPG20 mRNA 和蛋白表達均明顯上升。提示抑制DNMT3b的表達可以降低SPG20 基因甲基化率，促進SPG20的表達，進而發(fā)揮其促癌作用。

綜上所述，在肺腺癌中DNMT3b 的表達與SPG20甲基化水平密切相關，DNMT3b 的高表達促進了SPG20 的高甲基化狀態(tài)，二者可能是促進肺腺癌發(fā)生發(fā)展的重要生物學特征。將來可以DNMT3b 及SPG20 甲基化修飾作為切入點，深入研究其具體致癌機制，為肺腺癌的基因靶向治療提供新的理論依據(jù)。