活血靈方對大鼠下肢深靜脈血栓形成及Notch2/Hes－1表達的影響

侯彥杰，李小玲，劉園園，馬亮英，*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830063；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830028）

深靜脈血栓形成（Deep venous thrombosis，DVT）是指血液在深靜脈中非正常凝結(jié)，造成下肢靜脈回流障礙，血流緩慢、靜脈壁受損、高凝狀態(tài)為引發(fā)靜脈血栓的主要因素［1-2］，常有下肢腫脹、疼痛等表現(xiàn)，若不及時治療，血栓將會擴散至肢體深靜脈主干，嚴重影響患者生命安全［3］。中醫(yī)學(xué)認為DVT 屬于“股腫”范疇，是骨斷、筋斷導(dǎo)致血行不暢、瘀血阻滯、損傷血脈，活血靈方具有消腫止痛、活血化瘀等功效，能有效緩解髖關(guān)節(jié)術(shù)后患者DVT，并改善其凝血功能［4］，但其具體作用機制仍不清晰。多項研究表明DVT 與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，機體受到損傷后引起炎癥因子聚集，加速機體高凝狀態(tài)，引發(fā)血小板聚集、內(nèi)皮損傷等不良后果，最終造成血栓形成［5］。資料顯示氧化應(yīng)激反應(yīng)與肺動脈內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)，并參與肺栓塞形成［6-7］。Notch2 是Notch蛋白分子家族成員，通過激活Hes－1進行細胞間信息的傳遞，與機體氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)均有一定關(guān)聯(lián)［8-9］。但是關(guān)于深靜脈血栓、活血靈方與Notch1/Hes－1 信號通路之間的研究較少，本文通過建立下肢DVT大鼠模型，探究活血靈方對大鼠炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)及Notch1/Hes－1信號通路的影響。

1 材料

1.1 動物

50 只健康1 個月齡SPF 級SD 雄性大鼠，體質(zhì)量（260 ± 40）g，實驗動物許可證號：SCXK（粵）2016－0002，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。所有大鼠在本院動物房內(nèi)飼養(yǎng)，保持自然光照及通風(fēng)，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%，每周清潔1次鼠籠。

1.2 主要試劑及儀器

活血靈組方：紅花、當(dāng)歸、赤芍、柴胡、生地黃、續(xù)斷、羌活、牛膝、威靈仙和甘草（采購于仲景大藥房）；HE 染色試劑盒（產(chǎn)品編號：WH2144，上海威奧生物科技有限公司）；白細胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、白細胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA 試劑盒（貨號：ml102828、ml037361、ml002859、ml077384、ml097316、ml077379，上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；蛋白質(zhì)提取試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（貨號：R0010、PC0020，北京索萊寶科技有限公司）；Notch2、Hes－1、三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源一抗、羊抗兔IgG（貨號：ab137665、ab108937、ab8245、ab6728，Abcam）；C2000－4 全自動血凝儀（濟南來寶醫(yī)療器械有限公司）；F280SZ 全自動血液流變學(xué)儀（重慶邁迪克公司）；SMZ745 光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；MR－96A 全自動酶標儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備及分組給藥

50 只大鼠按照隨機數(shù)字表分為對照組、模型組和活血靈方低劑量組（6.3 g/kg）、中劑量組（12.6 g/kg）、高劑量組（25.2 g/kg），每組10 只。參考文獻［10］制備下肢DVT 大鼠模型并稍做修改，造模前大鼠禁食禁水8 h，將大鼠麻醉后仰臥位固定，將大鼠左側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)脫毛后消毒，縱向作約1.5 cm 的傷口，暴露股靜脈血管后用4－0 絲線結(jié)扎相鄰3 處股靜脈，然后縫合傷口，用髖人字形石膏固定大鼠大腿，對照組僅行縱向切口。采用肉眼直接觀察法驗證模型構(gòu)建是否成功，如觀察到大鼠雙足明顯腫脹、下肢皮膚顏色青紫，提示血栓形成；造模后24 h 可拆開皮膚縫線進一步驗證血栓形成情況，觀察到股靜脈管腔變粗、呈紫黑色，其中有深色物質(zhì)存在即表明下肢DVT 大鼠模型構(gòu)建成功。模型構(gòu)建成功后開始給藥。

活血靈方藥物制備：紅花、當(dāng)歸、赤芍各15 g，柴胡、生地黃、續(xù)斷、羌活、牛膝、威靈仙各12 g，甘草6 g，按照料液比為1 g∶10 mL 加入蒸餾水，浸泡藥材2 h 后開始加熱，煮沸30 min，過濾，藥渣繼續(xù)加入適量蒸餾水加熱煮沸0.5 h，合并2 次濾液，濃縮至含生藥量為2.52 g/mL 備用。參考文獻［11］設(shè)置活血靈方給藥劑量，按照各組給藥劑量進行灌胃處理，持續(xù)灌胃14 d，模型組及對照組灌胃等量蒸餾水。

2.2 大鼠血液及血栓靜脈組織標本采集

給藥結(jié)束后24 h，將大鼠麻醉，靜脈取血3 mL，測定各組大鼠凝血相關(guān)指標。腹主動脈取血，用于血液流變學(xué)指標檢測。獲取大鼠血栓形成處靜脈組織，2 只用于病理形態(tài)學(xué)觀察，8 只用于炎癥、氧化應(yīng)激因子及Notch2/Hes－1通路相關(guān)蛋白檢測。

2.3 大鼠凝血相關(guān)指標及血液流變學(xué)指標檢測

各組小鼠的D－二聚體水平（D－dimer）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）均用全自動血凝儀測定。全自動流變學(xué)儀中測定血漿黏度、纖維蛋白、紅細胞壓積。

2.4 大鼠血栓形成處靜脈組織形態(tài)學(xué)觀察

取“2.2”項中各組大鼠血栓形成處靜脈組織，修整后在4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后切成厚度約為4 μm的常規(guī)病理切片，按照HE染色試劑盒的要求進行染色，封片后于顯微鏡下拍照并觀察。

2.5 大鼠血栓形成處靜脈組織炎癥因子指標及氧化應(yīng)激指標檢測

取“2.2”項中各組大鼠血栓形成處靜脈組織，研磨成組織勻漿，離心后取上清液，按照IL－1β、IL－6、TNF－α、MDA、SOD、GSH－Px 相關(guān)試劑盒中的具體操作步驟進行測定。

2.6 大鼠血栓形成處靜脈組織Notch2/Hes－1通路相關(guān)蛋白檢測

取“2.2”項中各組大鼠血栓形成處靜脈組織，用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取其中蛋白質(zhì)，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定其中蛋白質(zhì)濃度，將各組待測樣品加熱變性后各取20 μL，SDS－PAGE 電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，經(jīng)吐溫－20－三羥甲基氨基甲烷鹽緩沖液（Tris－buffered saline with Tween－20，TBST）漂洗后置于5%的脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，加入Notch2（1∶300）、Hes－1（1∶300）、GAPDH（1∶1 000）兔抗鼠一抗，4 ℃冰箱中孵育過夜后用TBST漂洗3次，加入羊抗兔IgG（1∶1 000）并室溫孵育2 h，經(jīng)TBST漂洗、顯色、曝光后觀察結(jié)果并拍照。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗所得數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，單因素方差分析用組間比較，進一步兩組間比較用LSD－t檢驗分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 動物基本情況觀察

對照組大鼠生長狀況良好，傷口愈合較快；模型組大鼠活動減少，雙足明顯腫脹、下肢皮膚顏色青紫，拆開皮膚縫線可觀察到股靜脈管腔變粗、呈紫黑色，其中有深色物質(zhì)存在；活血靈方各劑量組大鼠上述情況均得到一定的改善。

3.2 各組大鼠血栓形成處靜脈組織形態(tài)學(xué)觀察

對照組大鼠血管形態(tài)正常；模型組大鼠血管內(nèi)存在血栓，血管壁呈炎性浸潤；與模型組相比，活血靈方各劑量組血管血栓量顯著減少，血管壁浸潤均得到一定的改善，并具有一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系，其中高劑量組改善效果較好。見圖1。

圖1 各組大鼠血栓形成處靜脈組織形態(tài)學(xué)比較（HE染色，×200）

3.3 活血靈方對各組大鼠血液凝血指標及血液流變指標的影響

與對照組相比，模型組大鼠D－dimer、血漿黏度、纖維蛋白、紅細胞壓積顯著升高（P＜0.05），APTT、TT顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，活血靈方各劑量組大鼠D－dimer、血漿黏度、纖維蛋白、紅細胞壓積顯著降低（P＜0.05），APTT、TT 顯著升高（P＜0.05），且具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。見表1。

表1 各組大鼠血液凝血指標比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠血液凝血指標比較（±s，n=10）

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與模型組相比，#P ＜0.05；與活血靈方低劑量組相比，△P ＜0.05；與活血靈方中劑量組相比，◇P ＜0.05。

組別對照組模型組活血靈方低劑量組活血靈方中劑量組活血靈方高劑量組紅細胞壓積（%）37.29±1.27 45.01±1.30*42.87±1.52*#40.94±1.30*#△39.05±1.31*#△◇D－dimer（μg/L）38.20±8.06 108.47±10.08*92.56±9.92*#75.91±9.81*#△59.24±9.77*#△◇APTT（s）39.64±6.17 17.95±1.89*22.16±2.68*#29.07±4.48*#△36.81±5.15*#△◇TT（s）19.06±1.83 9.89±0.85*11.68±0.91*#14.93±1.26*#△17.08±1.67*#△◇血漿黏度（μm）1.22±0.05 1.89±0.08*1.71±0.04*#1.55±0.04*#△1.34±0.05*#△◇纖維蛋白4.01±0.23 5.93±0.25*5.50±0.26*#4.94±0.27*#△4.35±0.18*#△◇

3.4 活血靈方對各組大鼠血栓形成處靜脈組織炎癥因子表達水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠血栓形成處靜脈組織中IL－1β、IL－6、TNF－α 表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，活血靈方各劑量組血栓形成處靜脈組織中IL－1β、IL－6、TNF－α 表達水平均顯著降低（P＜0.05），且具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。見表2。

表2 各組大鼠血栓靜脈組織炎癥因子指標比較（±s，n=8）

表2 各組大鼠血栓靜脈組織炎癥因子指標比較（±s，n=8）

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與模型組相比，#P ＜0.05；與活血靈方低劑量組相比，△P ＜0.05；與活血靈方中劑量組相比，◇P ＜0.05。

TNF－α（pg/mL）135.82±12.36 382.93±16.28*321.83±15.38*#257.29±14.16*#△186.97±13.61*#△◇組別對照組模型組活血靈方低劑量組活血靈方中劑量組活血靈方高劑量組IL－1β（pg/mL）193.61±12.38 394.33±17.21*345.01±16.05*#298.72±15.78*#△232.66±13.06*#△◇IL－6（pg/mL）103.47±10.26 213.46±17.75*186.39±16.05*#161.59±14.39*#△133.77±11.28*#△◇

3.5 活血靈方對各組大鼠血栓形成處靜脈組織氧化應(yīng)激指標的影響

與對照組相比，模型組大鼠血栓形成處靜脈組織中MDA 表達水平顯著升高（P＜0.05），SOD、GSHPx 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，活血靈方各劑量組大鼠血栓形成處靜脈組織中MDA 表達水平顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH－Px 表達水平顯著升高（P＜0.05），呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。見表3。

表3 各組大鼠血栓靜脈組織氧化應(yīng)激指標比較（±s，n=8）

表3 各組大鼠血栓靜脈組織氧化應(yīng)激指標比較（±s，n=8）

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與模型組相比，#P ＜0.05；與活血靈方低劑量組相比，△P ＜0.05；與活血靈方中劑量組相比，◇P ＜0.05。

GSH－Px（U/mg）257.31±12.58 194.71±9.46*208.26±10.17*#224.91±11.51*#△240.38±11.63*#△◇組別對照組模型組活血靈方低劑量組活血靈方中劑量組活血靈方高劑量組MDA（nmol/mg）5.97±1.01 17.03±1.85*14.82±1.47*#11.37±1.59*#△8.01±1.33*#△◇SOD（U/mg）125.46±8.19 85.95±4.23*96.83±6.81*#104.74±7.56*#△116.39±8.09*#△◇

3.6 活血靈方對各組大鼠血栓形成處靜脈組織Notch2/Hes－1 通路相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組大鼠血栓形成處靜脈組織Notch2、Hes－1蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，活血靈方各劑量組大鼠血栓形成處靜脈組織Notch2、Hes－1蛋白表達顯著降低（P＜0.05），具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。見表4和圖2。

圖2 各組大鼠血栓靜脈組織Notch2/Hes－1通路相關(guān)蛋白表達

表4 各組大鼠血栓靜脈組織Notch2/Hes－1通路相關(guān)蛋白表達比較（±s，n=8）

表4 各組大鼠血栓靜脈組織Notch2/Hes－1通路相關(guān)蛋白表達比較（±s，n=8）

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與模型組相比，#P ＜0.05；與活血靈方低劑量組相比，△P ＜0.05；與活血靈方中劑量組相比，◇P ＜0.05。

Hes－1/GAPDH 0.91±0.15 2.05±0.29*1.76±0.23*#1.49±0.20*#△1.23±0.18*#△◇組別對照組模型組活血靈方低劑量組活血靈方中劑量組活血靈方高劑量組Notch2/GAPDH 0.85±0.11 1.98±0.25*1.68±0.23*#1.43±0.19*#△1.15±0.17*#△◇

4 討論

DVT 為髖關(guān)節(jié)置換等骨科手術(shù)術(shù)后常見并發(fā)癥［12］，以下肢深靜脈血栓為主，常伴有肢體疼痛、腫脹等表現(xiàn)［13］。資料顯示靜脈結(jié)扎法構(gòu)建深DVT 動物模型可完全阻塞血流，導(dǎo)致靜脈內(nèi)皮細胞受損，血流瘀滯，所建立的模型穩(wěn)定、可靠［14］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠活動減少，雙足明顯腫脹、下肢皮膚顏色青紫，拆開皮膚縫線可觀察到股靜脈管腔變粗、呈紫黑色、其中有深色物質(zhì)存在，血管壁受損嚴重，表明下肢DVT 大鼠模型構(gòu)建成功?；钛`方主要由紅花、當(dāng)歸、赤芍等藥物組成，具有活血化瘀、消腫止痛、降低血液黏稠度、增加血流量等功效，可有效防治深靜脈血栓形成［15］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過活血靈方治療的模型大鼠血管壁受損、血栓形成、下肢腫脹等不良癥狀均得到緩解，提示活血靈方可顯著緩解下肢DVT大鼠的病情，但其具體機制仍不清晰。

血栓形成機制復(fù)雜，機體高凝狀態(tài)、高黏血癥等因素與深靜脈血栓的形成密切相關(guān)，APTT、TT、D－dimer是凝血功能重要指標，APTT、TT縮短、D－dimer升高提示患者纖溶活性異常、血液存在高凝狀態(tài)，有利于血栓形成［16］。血栓形成與機體炎癥反應(yīng)聯(lián)系密切，BITTAR等［17］研究發(fā)現(xiàn)DVT 患者血清IL－6 等炎癥因子水平顯著升高，是血栓形成的危險因素，血管發(fā)生損害后，炎癥因子迅速集中，血管損傷部位受到炎性浸潤，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙并加速機體高凝狀態(tài)，進而促進血栓形成［18］。EKIM 等［19］研究結(jié)果顯示，DVT 患者機體氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著增加，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)也參與了血栓形成。機體抗氧化能力不足、自由基增多等均可引起機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在正常生理條件下，抗氧化物質(zhì)通過SOD、GSH－Px、CAT 等自由基清除酶對機體的氧化應(yīng)激起保護作用，從而減輕血管內(nèi)皮損傷，維持血管舒張功能，降低血栓形成幾率［19-20］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠血漿D－dimer、血漿黏度、纖維蛋白、紅細胞壓積水平顯著升高，APTT、TT值顯著縮短，血栓形成處靜脈組織中IL－1β、IL－6、TNF－α、MDA 水平顯著升高，SOD、GSH－Px 水平顯著降低，提示DVT 大鼠機體存在凝血功能異常、血流受阻、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，經(jīng)過活血靈方治療后，大鼠的凝血功能逐漸恢復(fù)正常，血漿黏度逐漸降低，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)均得到緩解，表明活血靈方可通過減輕炎癥反應(yīng)，提高機體抗氧化能力發(fā)揮緩解血栓形成的作用。

Notch信號通路廣泛存在于機體多種組織中，具有4種受體，Notch2是其中之一，資料顯示Notch2/Hes－1通路與機體炎性反應(yīng)密切相關(guān)，機體缺血等因素均可激活Notch2/Hes－1 通路，Notch2 蛋白與Hes－1 結(jié)合可引起下游炎癥控制基因的激活，促使機體IL－1β、TNF－α 等炎癥因子的大量釋放，最終導(dǎo)致機體損傷［21-22］；王寧等［23］研究表明，上調(diào)Notch 通路可加重機體氧化應(yīng)激損傷，抑制Notch 信號通路可保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，經(jīng)過活血靈方治療的大鼠血栓形成處靜脈組織Notch2、Hes－1 蛋白表達顯著降低，提示活血靈方可能通過抑制Notch2/Hes－1 通路降低DVT 大鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而發(fā)揮其緩解DVT的作用。

綜上所述，活血靈方可能通過抑制Notch2/Hes－1通路緩解DVT 大鼠病情，但其所含藥物種類較多，作用機制復(fù)雜，但本研究并未進行相關(guān)通路抑制劑對比實驗，因此仍需深入研究。