甘草苷對急性灌酒小鼠肝損傷的保護作用

張芬芬，程夢迪，周珊珊，柳金可，王 榮

（阜陽師范大學 胚胎發(fā)育與生殖調節(jié)安徽省重點實驗室，安徽 阜陽 236037）

急性酒精性肝損傷發(fā)病機制復雜，乙醇及其毒性代謝產物、脂質過氧化、氧化應激、炎性反應等均參與其中[1]嚴重者還會因急性酒精中毒而死亡。急性酒精性肝損傷是由于過量飲酒所導致肝臟代謝紊亂，且目前其發(fā)病率逐年升高[2]。在我國,酒精性肝病僅次于病毒性肝炎，已成為引起肝功能損害的第二大病因[3]。因此酒精性肝損傷已經(jīng)嚴重影響人類健康?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘草具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘等作用[4-5]。甘草苷(Liquiritin，LIQ)作為一種單體活性物質是甘草中的主要黃酮類化合物，具有抗抑郁，保護神經(jīng)、心臟系統(tǒng)等多種藥理活性[6]。Ji-Yeon Yu[7]等人研究表明甘草苷能抑制叔丁基過氧化氫模型小鼠肝臟促炎細胞因子的表達水平，可用于治療炎癥相關疾病，陳云華[8]等人研究了甘草苷對醋氨酚人肝細胞損傷模型具有一定的保護作用，但甘草苷對急性酒精性肝臟損傷是否具有保護作用尚不明確。因此，本實驗擬通過檢測添加甘草苷后急性灌酒小鼠血清中ADH 水平，肝臟中ADH、MDA、SOD水平來研究甘草苷對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康KM 小鼠50 只，雄性，體重30～35 g，由浙江維通利華實驗動物技術有限公司桐鄉(xiāng)分公司提供，許可證號:SCXK(浙)2020-0002，合格證號：20210126Abzz0600000382。

1.2 主要試劑及儀器

甘草苷(北京索萊寶科技有限公司)，無水乙醇(阿拉丁加蒸餾水稀釋備用)，Bradford 法蛋白檢測試劑盒、乙醇脫氫酶(ADH)測試盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所），精密分析天平（Mettler Toledo）、低溫離心機（Eppendord）、酶標儀（Tecan）。

1.3 動物分組、給藥與造模

實驗小鼠飼養(yǎng)環(huán)境21～23℃，50 只健康KM小鼠適應性喂養(yǎng)一周。按體重隨機分為對照組、酒精組及給藥組（甘草苷低、中、高三個劑量組）共五組[9]，每組10 只。每天1 次，連續(xù)7 d 灌服給藥。對照組、酒精組分別按與給藥組等體積灌服蒸餾水，其余各組分別灌服相應劑量甘草苷(分別為低劑量組10 mg/kg，中劑量組20 mg/kg，高劑量組40 mg/kg)，第7 d 末次給藥后1 h，除對照組外其余各組按12 ml/kg 劑量一次性灌胃50%酒精（用無水乙醇稀釋，下同)造模[10]建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，灌胃50%酒精后小鼠禁食不禁水。

1.4 指標檢測及方法

1.4.1 狀態(tài)觀察

觀察各組動物的一般情況，包括精神、活動狀況、飲食、排便等。

1.4.2 血清生化指標測定

第7 d 灌胃酒精造模成功12 h 后，眼球靜脈取血，血液靜置1 h，4℃低溫下進行離心，4000 r/min 離心10 min 后取上清液，根據(jù)乙醇脫氫酶(ADH)測試盒測ADH 活力。

1.4.3 肝臟生化指標測定

第7 d 灌胃酒精造模成功12 h 后，脫頸處死解剖取肝臟，研磨成10%的肝組織勻漿4℃低溫下進行離心，4000 r/min 離心10 min 后取上清液，根據(jù)乙醇脫氫酶(ADH)測試盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測試盒測ADH、MDA、SOD 含量和活力。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用GraphPadPrism8 統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析，計量資料以(Mean&SEM)表示，各組間比較采用(one-way ANOVA)檢驗。檢驗水準:a=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 狀態(tài)觀察

造模前小鼠生活狀態(tài)正常，毛色光澤，黑褐色顆粒樣大便;進食及飲水均正常。給予酒精造模后，除正常對照組外，其余各組小鼠先表現(xiàn)為行動緩慢，轉而進入嗜睡醉酒狀態(tài)，進食少，毛散亂。

圖1 血液各組ADH 活力。A.正常組，B.酒精組，C.甘草苷低劑量組，D.甘草苷中劑量組，E.甘草苷高劑量組。

2.2 血清指標的比較

實驗結果顯示，酒精組與對照組比較，其血清ADH 水平均有升高，表明造模成功，小鼠經(jīng)一次性灌胃50%酒精后出現(xiàn)肝臟損傷；甘草苷各劑量組與酒精組比較，小鼠的血清ADH 水平均升高(p＜0.05)；甘草苷各劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 肝功能指標的比較

酒精組與對照組比較，其肝臟ADH 水平有所升高，甘草苷低、高劑量組與酒精組比較，小鼠的肝臟ADH 水平均升高(均p＜0.05)；酒精組與對照組比較，其肝臟SOD 水平有所降低，甘草苷中劑量組與酒精組比較，小鼠的肝臟ADH 水平差異不明顯。甘草苷各劑量組與酒精組比較，小鼠的肝臟SOD 水平均升高(均p＜0.05)；酒精組及給藥組與對照組比較，其肝臟MDA 水平整體趨勢呈現(xiàn)無顯著性差異，甘草苷中劑量組MDA 值升高可能存在一定的偏差。綜合表明甘草苷對酒精損傷的肝臟有一定的保護作用。

圖2 肝臟各組ADH 活力。A.正常組，B.酒精組，C.甘草苷低劑量組，D.甘草苷中劑量組，E.甘草苷高劑量組。）

圖3 肝臟各組SOD 活力。A.正常組，B.酒精組，C.甘草苷低劑量組，D.甘草苷中劑量組，E.甘草苷高劑量組。）

圖4 肝臟各組MDA 含量。A.正常組，B.酒精組，C.甘草苷低劑量組，D.甘草苷中劑量組，E.甘草苷高劑量組。）

3 討論

酒精性肝病的發(fā)病機制復雜，肝臟是酒精代謝最主要的器官，酒精進入肝臟首先在乙醇脫氫酶的作用下代謝為乙醛，再通過乙醛脫氫酶代謝成乙酸，最后分解成水和二氧化碳排出體外[11]。過量飲酒肝臟代謝負荷增大，不能及時將有害物質分解排除體外，因此會引起細胞內相關代謝通路紊亂，使肝細胞產生炎癥反應和氧化應激反應，導致肝臟脂質化、纖維化等，從而誘發(fā)肝細胞損傷[12-13]。過量的乙醇攝入可降低肝臟內抗氧化系統(tǒng)的活性，減弱SOD 等抗氧化能力，破壞機體的氧化和抗氧化平衡，引起氧化應激，導致脂質過氧化的連鎖反應，以及線粒體功能損傷、內質網(wǎng)應激和免疫炎性反應等引起的肝損傷[14]。MDA 是脂質過氧化的重要產物，其含量高低可反映機體內脂質過氧化的強度[15]，酒精性肝損傷過程中肝臟內氧化應激標志物如MDA、SOD 等的含量均明顯改變。短時間大量飲酒會損傷肝組織，主要和抗氧化損傷、脂質過氧化及免疫損傷等因素相關[16]，降低肝臟的氧化應激反應，從而達到醒酒護肝作用是近年來中醫(yī)藥研究的熱點[17]中藥及其有效成分[18]具有改善肝功能、減輕氧化應激損傷[19]、調節(jié)免疫功能、減少炎癥、減少細胞凋亡、保護肝臟免受損傷的作用。這些研究為今后開發(fā)保肝藥物奠定了基礎[20]。甘草中的主要成分為三萜類和黃酮類，其中甘草苷是黃酮類化合物中重要的單體活性成分，具有很強的藥理活性[6]。甘草苷通過促進細胞凋亡以劑量依賴的方式抑制腫瘤生長[21]。甘草苷能夠通過雙重抑制TRPV_1 和TRPA_1 通道介導，表現(xiàn)出抗炎鎮(zhèn)咳作用[22]。甘草苷通過ROS 介導的絲裂原活化蛋白激酶/Akt/NFκB 信號通路抑制肝癌細胞增殖并誘導其凋亡[23]。因此探究甘草苷對急性灌酒小鼠肝損傷的保護作用具有重要的研究意義。

本實驗結果顯示應用甘草苷可以顯著提高血清和肝組織中ADH 和SOD 水平，當血液中的乙醇濃度過高時，乙醇主要通過ADH 代謝系統(tǒng)進行氧化，而提高ADH 活力可以加速乙醇的代謝過程，可見甘草苷具有解酒功能。檢測肝臟各組ADH 活力時，甘草苷中劑量組與酒精組相比差異不明顯，但相對于酒精組還是有一定的提高，可能是由于一定的偏差造成，但具體原因還需進一步探究。SOD 是作用于超氧陰離子自由基的專一歧化反應催化劑，SOD 作為醫(yī)藥產品，在治療因自由基作用而導致的炎癥、自身免疫性、心腦血管疾病等都有著顯著療效。[24]SOD 可利用其抗氧化作用抑制炎癥反應，甘草苷能夠提高機體SOD 活力，表明其能增強機體抗氧化作用，說明甘草苷對肝臟損傷具有一定的保護作用。本實驗采用的方法是單次大量高濃度酒精灌胃構建急性酒精性肝損傷模型，結果顯示酒精組小鼠血清和肝臟中ADH水平均有所升高，說明機體在接受大量酒精時，自身進行了一定的代謝過程。酒精組肝臟SOD 活力有所下降，說明機體一次性飲用大量酒精會降低自身的抗氧化能力。給藥組SOD 活力升高說明給藥后提高了機體清除氧自由基的能力，而各組MDA 含量未顯示出顯著性差異，可能是由于急性灌酒后短時間內機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度差異還未明顯表現(xiàn)。甘草苷對急性酒精性肝損傷具有一定的保護作用，這可能與甘草苷可在一定程度上改善脂質過氧化、增強受損肝臟抗氧化能力、減少炎癥反應有關，其作用機制需要更進一步的研究探索。