酒糟泥中纖維素降解菌的篩選與鑒定

余梅霞，朱 玉，程 丹，陸 娟

（阜陽(yáng)師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037）

纖維素是世界上最豐富的天然有機(jī)高分子化合物，是植物的結(jié)構(gòu)多糖及某些真菌和細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是D-葡萄糖通過(guò)β-1,4 糖苷鍵連接的線性同多糖。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是農(nóng)作物秸稈的主要組成成分，但是它們?cè)诓煌斩挿N類(lèi)或同一種作物秸稈不同部位的含量不同[1]。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年約產(chǎn)生7 億t 農(nóng)作物秸稈[2]。雖然農(nóng)作物秸稈是一種可再生的生物質(zhì)資源，大部分卻沒(méi)有得到充分有效的利用。

目前，加速纖維素降解最常見(jiàn)的方法有物理法、化學(xué)法、生物法和它們相互結(jié)合的方法，但各有優(yōu)缺點(diǎn)[3]。物理法對(duì)環(huán)境安全無(wú)污染，但設(shè)備投資大，能耗多；化學(xué)法（酸或堿）處理對(duì)儀器的耐腐蝕性要求較高，還存在回收、中和與洗滌等復(fù)雜工序；雖然以微生物為代表的生物法反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，但是反應(yīng)的條件較溫和，對(duì)設(shè)備要求較低，后續(xù)工作不復(fù)雜。因此，篩選、研究具有纖維素降解能力的菌株成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，奧爾森青霉（Penicillium olsonii）[4]、伯氏短桿菌（Brevibacillus boorstelensis）[5]、努比鹵地?zé)o氧芽孢桿菌（Anoxybacillus rupiensis）[6]和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[7,8]等菌株都具有降解纖維素的能力。

為了進(jìn)一步尋找具有纖維素降解能力的菌株，不斷開(kāi)發(fā)纖維素降解菌的潛能，仍需繼續(xù)篩選、分離纖維素降解菌。本文從酒糟泥中篩選具有降解纖維素能力的菌株，并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行初步鑒定，豐富了纖維素降解菌資源，為進(jìn)一步研究該菌株的纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)及酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-50FBS）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F）、生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z）、PCR儀（T100）、電泳儀（DYY-11）、高速臺(tái)式離心機(jī)（TGL-20B）、紫外分光光度計(jì)（723N）、掃描電子顯微鏡（Sigma 500）。

1.2 培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基（g/L）：MgSO4·7H2O 0.1，KH2PO40.5，CaCl20.1，K2HPO42，CMC-Na 10，(NH4)2SO42，瓊脂15，pH 7.0～7.4。121℃滅菌20 min。

濾紙酶（FPase）活檢測(cè)培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏10，氯化鈉1.5，新華濾紙0.05，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.3，pH 7.0。121℃滅菌20 min。

1.3 土壤來(lái)源

從阜陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院省級(jí)釀酒技術(shù)工程實(shí)踐教育中心的酒窖中取酒糟泥，均質(zhì)袋密封保存。

1.4 纖維素降解菌的篩選

1.4.1 初篩

將10 g 土樣加入到裝有90 mL 無(wú)菌水的錐形瓶中（內(nèi)有少量玻璃珠），搖勻，此時(shí)濃度為10-1。取1 mL 混合液依次用9 mL 無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)@得10-2、10-3、10-4、10-5和10-6濃度的混合菌液。分別從10-3、10-4、10-5和10-6四個(gè)梯度吸取200 μL 混合液涂布于CMC-Na 平板，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落進(jìn)行平板劃線法分離純化，LB 斜面保種，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 復(fù)篩

從初篩獲得的菌株中挑取單菌落點(diǎn)種于CMC-Na 平板上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d，剛果紅染色復(fù)篩，方法同文獻(xiàn)[9]。觀察并測(cè)定透明圈的直徑與菌落直徑，通過(guò)比較前者與后者的比值大小來(lái)判定各菌株降解纖維素能力的強(qiáng)弱。

1.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱(chēng)取100℃干燥0.5 h 的葡萄糖粉末0.1 g，蒸餾水定容至100 mL。分別取葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 和1.4 mL 置于8 只試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL。向每只試管中加入DNS溶液3 mL，煮沸10 min，冷卻后用蒸餾水定容至20 mL，測(cè)量OD540值。以O(shè)D540為縱坐標(biāo)、葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程y=0.2551x+0.0113，R2=0.9929。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.6 FPase 酶活力的檢測(cè)

將透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株FIB-3 接種50 mL 濾紙酶活檢測(cè)培養(yǎng)基，160 rpm、37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜獲得種子培養(yǎng)液，按10%（v/v）接種量接種酶活檢測(cè)培養(yǎng)基，160 rpm、37℃搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h 取發(fā)酵液，4℃、6000 rpm 離心10 min，取1 mL 上清加入到1 mL 0.2 mol/L pH 4.8 的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，加入新華濾紙條（6×1 cm），待濾紙條混勻于液體后，50℃酶促反應(yīng)30 min，以沸水滅活10 min 的發(fā)酵上清液為空白對(duì)照，取出后迅速進(jìn)行DNS 法測(cè)定還原糖生成量，并計(jì)算FPase 酶活力。以每分鐘每毫升發(fā)酵上清液酶促反應(yīng)釋放1 μg 葡萄糖的量為一個(gè)酶活單位（U）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 菌株FIB-3 的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察 將菌株FIB-3 劃線、37℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)將該菌株進(jìn)行電鏡掃描觀察。電鏡掃描的步驟如下：取菌株FIB-3 菌苔于磷酸緩沖液中，離心、棄上清；加入電鏡固定液，4℃固定3 h，離心、棄上清；磷酸緩沖液洗滌菌體5 min 兩次，離心、棄上清；依次向菌體中加入10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%濃度的乙醇進(jìn)行脫水，靜置10 min，離心、棄上清；加入適量乙酸異戊脂溶液，靜置30 min 進(jìn)行干燥，離心、棄上清；用無(wú)菌接種環(huán)將菌體取出放在無(wú)菌的濾紙上，包好后自然風(fēng)干，倒入干凈無(wú)水的研缽中碾碎，用干燥的濾紙包好備用；用牙簽蘸取少量碾碎的菌體輕輕地涂于掃描電鏡樣品臺(tái)上，再經(jīng)噴金處理后置于掃描電鏡下觀察。

（2）分子生物學(xué)分析 將菌株FIB-3 接種LB培養(yǎng)基，160 rpm、28℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，5 000 rpm、4℃離心10 min，棄上清液；TE 懸浮沉淀，加入10%的SDS 溶液、蛋白酶K，混勻，55℃水浴1 h；加入5 mol/L 的NaCl 溶液，混勻，加入CTAB/Na-Cl 溶液，混勻，65℃水浴20 min；加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）溶液，5 000 rpm、4℃離心10 min，取上清液，加入等體積的異丙醇溶液，混勻，室溫靜置10 min，5 000 rpm、4℃離心5 min；棄上清液，70%乙醇漂洗沉淀，5 000 rpm、4℃離心5 min，棄上清；空氣中靜置使乙醇揮發(fā)，加入TE 溶解沉淀，將DNA 基因組樣品－20℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉腄NA 基因組以通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[10]，將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，利用BLASTN 軟件和MEGA 6.0 軟件進(jìn)行比對(duì)和分析，NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

從酒糟泥圖樣中初步篩選出4 株長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株，分別命名為FIB-1、FIB-2、FIB-3 和FIB-4。

將4 株菌FIB-1、FIB-2、FIB-3 和FIB-4 點(diǎn)種于CMC-Na 平板后倒置培養(yǎng)2 d，經(jīng)剛果紅染色發(fā)現(xiàn)FIB-3 透明圈最明顯，透明圈直徑與菌落直徑比值為1.88±0.175。

圖2 菌株FIB-3 產(chǎn)生的透明圈

2.2 菌株FIB-3 濾紙酶活的測(cè)定

菌株FIB-3 接種濾紙酶活檢測(cè)培養(yǎng)基，搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h 取樣、離心取上清進(jìn)行酶促反應(yīng)，DNS 法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定還原糖生成量，計(jì)算FPase 酶活力。6 d 中菌株FIB-3 的濾紙酶活先隨著時(shí)間的增加而增加，到第5 d 增至最高（8.436 U/mL），隨后降低（圖3）。

圖3 菌株FIB-3 濾紙酶活力的測(cè)定

2.3 菌株FIB-3 的鑒定

菌株FIB-3 菌落呈乳白色，光滑圓球狀，表面濕潤(rùn)粘稠（圖4-A），菌體桿狀（圖4-B），革蘭氏染色呈陽(yáng)性。

圖4 菌株FIB-3 菌落形態(tài)（A）及電鏡掃描圖（B）

將菌株FIB-3 提取的基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，BLASTN 比對(duì)分析上海生工所測(cè)序列。結(jié)果顯示菌株FIB-3 為芽孢桿菌（Bacillus sp.），在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CBMB205 聚在一起（圖5）。因此，菌株FIB-3 初步確定為一株貝萊斯芽孢桿菌。

圖5 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論與討論

纖維素酶由內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase）、外切葡聚糖酶（FPase）和β-葡萄糖苷酶組成的復(fù)合酶[11]，可以將纖維素降解為葡萄糖。雖然可以從網(wǎng)翅目、直翅目、鞘翅目等昆蟲(chóng)體內(nèi)的消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶[12]，但纖維素酶主要來(lái)源于微生物。細(xì)菌[7,8]、放線菌[13]、酵母菌[14]和霉菌[4]都可以產(chǎn)生纖維素酶，其中還有部分不可培養(yǎng)微生物也可以產(chǎn)生纖維素酶[15]。

本文利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基從酒糟泥中初步篩選出4 株（FIB-1、FIB-2、FIB-3 和FIB-4）具有纖維素降解能力的菌株，經(jīng)剛果紅染色復(fù)篩時(shí)菌株FIB-3 透明圈直徑與菌落直徑比值（1.88±0.175）最大；DNS 法測(cè)出該菌株在第5 d 時(shí)濾紙酶活達(dá)到最高（8.436 U/mL）；根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)分析，初步確定菌株FIB-3 為一株貝萊斯芽孢桿菌。

貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，最早于1999 年分離自西班牙一條名為貝萊斯河流(Vélez)的河口，卻在2005 年才被首次報(bào)道[16]。貝萊斯芽孢桿菌能夠產(chǎn)生細(xì)菌素、抑菌蛋白、脂肽類(lèi)物質(zhì)和聚酮化合物等多種抗菌物質(zhì)，還可以產(chǎn)生赤霉素、吲哚乙酸等植物激素，具有廣譜的抑菌和促生作用，在動(dòng)植物病害的生物防治方面被廣泛應(yīng)用[17,18]。

目前，對(duì)貝萊斯芽孢桿菌具有纖維素降解活性的報(bào)道較少。2019 年陳龍等對(duì)一株杜仲樹(shù)皮內(nèi)生菌貝萊斯芽孢桿菌的內(nèi)切纖維素酶進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)分析[19]，但沒(méi)有對(duì)其濾紙酶活進(jìn)行研究。本文僅對(duì)菌株FIB-3 的濾紙酶活進(jìn)行測(cè)定，沒(méi)有做CMCase 酶活。在后期的研究中，我們將對(duì)菌株FIB-3 的CMCase 酶活、這兩種酶的性質(zhì)以及該菌株的生防功能進(jìn)行進(jìn)一步分析。

4 小結(jié)

本文利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基從酒糟泥中初步篩選出4 株具有纖維素降解能力的菌株，其中菌株FIB-3 剛果紅染色時(shí)透明圈直徑與菌落直徑比值最大，并且該菌株在第5 d 時(shí)濾紙酶活達(dá)到最高；結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)分析，初步確定菌株FIB-3 為一株貝萊斯芽孢桿菌。