液相色譜－串聯質譜法測定植物源性食品中總氟吡禾靈殘留

王興寧，王 濤，李 潔，李 志，唐亞峰，梁藝馨，朱 明

（1. 貴陽海關綜合技術中心，貴州 貴陽 550081；2. 貴州輕工職業(yè)技術學院，貴州 貴陽 540003）

氟吡禾靈屬于苯氧羧酸類除草劑，主要以氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈2 種形式生產。兩者均為出苗前和出苗后選擇性除草劑，用于控制闊葉作物中的禾本科雜草，其機理是抑制乙酰輔酶A 羧化酶（ACCase），導致脂肪酸合成受阻［1－2］。該化合物的分子結構含有酯和羧基，其酯類在土壤或植物中迅速降解為其母體酸，并通過酯鍵、糖苷鍵或其他鍵與基質組分共價結合，在作物中形成二級共軛殘基［3－4］。苯氧羧酸類除草劑及其代謝降解產物對哺乳動物、魚類、鳥類和人類毒性很低，但攝入一定量的該類除草劑可引起腹瀉、食欲減退、抑郁，出現肺、肝臟、脾臟和腦膜的嚴重充血等毒性反應。因此，歐盟、日本和美國等國家和地區(qū)均對其在農產品中的殘留規(guī)定了嚴格限量。

GB 2763－2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》規(guī)定了氟吡甲禾靈、氟吡禾靈及其共軛物之和，以氟吡甲禾靈表示，在葵花籽、結球甘藍及柑橘等植物源性食品中的最大殘留限量為0.02～3 mg/kg［5］。歐盟農藥殘留法規(guī)（EU）No.396/2005 修訂了植物源性食品中氟吡禾靈（總氟吡禾靈，氟吡禾靈及其酯、鹽和共軛物的總和，以氟吡禾靈表示）的最大殘留限量為0.01～0.5 mg/kg［6］。日本肯定列表規(guī)定氟吡禾靈在豌豆、洋蔥及柑橘等植物源性食品中的最大殘留限量為0.01～0.5 mg/kg［7］。然而，當前國內外對植物源性食品中總氟吡禾靈的測定方法標準甚少。文獻報道氟吡禾靈的檢測方法主要有氣相色譜法［8－9］、氣相色譜－質譜法［10］、液相色譜法［11］和液相色譜－串聯質譜法［12－18］等。運用氣相色譜法和氣相色譜－質譜法時，需對目標物進行衍生化，存在衍生副產物干擾嚴重、回收率低等缺點；液相色譜法的靈敏度高，但在檢測復雜基質（如茶葉樣品）時確證困難；液相色譜－串聯質譜法是檢測氟吡禾靈的最佳技術手段，但目前的研究以檢測單一目標物的氟吡禾靈和氟吡甲禾靈殘留為主，對總氟吡禾靈殘留缺少較為全面系統(tǒng)的研究，同時亦未對大米、檸檬、柑橘、馬鈴薯、茶葉等9 種植物源性食品基質進行考察。本文采用基質分散固相萃取進行樣品前處理，結合液相色譜－串聯質譜建立了植物源性食品中總氟吡禾靈殘留的測定方法。實驗優(yōu)化了各種基質樣品的最佳水解條件，以評估氟吡禾靈酯和共軛物的轉化效率，同時優(yōu)化了基質分散固相萃取條件，以適應各種基質類型樣品的凈化。該方法可為總氟吡禾靈殘留日常監(jiān)控提供實用的技術手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Sciex API 5500 Q型超高效液相色譜－串聯質譜儀，配備電噴霧離子源和Analyst1.5.1工作站（美國AB公司），高速分散機（i國IKA公司），Sigma 3K15離心機（美國Sigma公司）。

乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸（色譜純，上海安譜有限公司）；實驗用水為Elix/Milli-Q 高純水（美國Millipore 公司）；氫氧化鈉、硫酸（優(yōu)級純，上海國藥集團）；無水硫酸鎂、乙酸鈉（農殘級，阿拉丁試劑公司）；N-丙基乙二胺（PSA，40～60 μm）、石墨化炭黑（GCB，30～90 μm）、十八烷基硅烷（C18，50 μm，60 ?）（農殘級，上海安譜有限公司）。

氟吡禾靈（CAS 號69806－34－4）、氟吡甲禾靈（CAS 號69806－40－2）和氟吡乙禾靈（CAS 號87237－48－7）（北京壇墨質量檢測技術有限公司）；同位素內標（±）氟吡禾靈-D4（純度99.0%，加拿大Toronto Research Chemical公司）。

以乙腈為溶劑，分別配制質量濃度為100 μg/mL 的氟吡禾靈、氟吡甲禾靈、氟吡乙禾靈和氟吡禾靈-D4（內標）的單個標準儲備溶液，并于－20 ℃下儲存。以乙腈為溶劑，配制含有氟吡禾靈、氟吡甲禾靈及氟吡乙禾靈2.5、5.0、10、25、50 ng/mL（含內標50 ng/mL）的系列混合標準溶液，現配現用。

植物源性食品（檸檬、柑橘、馬鈴薯、結球甘藍、甜椒、洋蔥、大米、葵花籽及茶葉）的樣品購自貴陽當地超市。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件 ACQUITYUPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters 公司）；柱溫為40 ℃；樣品室溫度為15 ℃；進樣量為10 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈；流速為0.2 mL/min。梯度洗脫程序如下：0～0.20 min，10% B；0.20～3.00 min，10%～50% B；3.00～7.00 min，50%～75%B；7.00～7.01 min，75%～10%B；7.01～10.0 min，10%B。

1.2.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；多反應監(jiān)測（MRM）；正離子掃描；離子化電壓為－4 500 V；離子源溫度為400 ℃；氣簾氣壓力為1.38×105Pa；離子源噴霧氣壓力為2.07×105Pa；碰撞氣壓力為4.14×104Pa。MRM模式下的質譜參數見表1。

表1 MRM模式下的質譜參數Table 1 MS parameters in MRM mode

1.3 樣品提取與凈化

1.3.1 高水分含量樣品的提取 準確稱取5 g 樣品（精確至0.01 g）置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入50 μL 內標（10 μg/mL）渦旋混勻，再加入10 mL 乙腈和2 mL 5 mol/L NaOH 渦旋混勻，40 ℃水浴超聲水解和提取30 min，加入2 mL 2.5 mol/L H2SO4渦旋混合，酸化后的樣品提取液pH 值為5～7，加入6 g無水MgSO4和1.5 g乙酸鈉劇烈振搖30 s，以5 000 r/min離心5 min，收集上清液。

1.3.2 低水分含量樣品的提取 準確稱取5 g 樣品（精確至0.01 g）置于50 mL 聚丙烯離心管中，茶葉樣品稱取2 g（精確至0.01 g），加入50 μL 內標（10 μg/mL）渦旋混勻，加入10 mL 水渦旋混合后靜置30 min，再加入10 mL 乙腈和2 mL 5 mol/L NaOH渦旋混勻，后續(xù)操作同“1.3.1”。

1.3.3 凈 化 在2 mL微型離心管中預裝150 mg無水MgSO4、50 mg C18和50 mg GCB，吸取提取的乙腈相至離心管中，渦旋振蕩5 min 后6 000 r/min 離心1 min，上清液經0.22 μm 有機濾膜過濾于2 mL 進樣小瓶，待測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

比較了ESI－和ESI+兩種模式下氟吡禾靈、氟吡禾靈-D4、氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈的信號強度。以含5 mmol/L 乙酸銨的甲醇－水（1∶1，體積比）配制100 ng/mL 上述4種化合物的標準溶液，并以10 mL/min的流速直接注入質譜。結果表明，氟吡禾靈和氟吡禾靈-D4在ESI－和ESI+兩種模式下均有較高的信號強度，而氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈僅在ESI+模式下具有較高的信號強度。因此，采用ESI+模式可實現所有目標物的同時監(jiān)測，并進一步優(yōu)化ESI+模式下MRM 的母離子、子離子、碰撞能量和去簇電壓，每個目標物選擇豐度較高、干擾最少的2組離子對用于MRM監(jiān)測。最終優(yōu)化的質譜條件如“1.2.2”所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

氟吡禾靈和氟吡禾靈酯屬于中等極性和弱極性化合物，在弱極性的C18柱上均具有較好的保留。實驗比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Agilent ZORBAX SB－C18（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）的分離效果，結果表明，兩柱均能較好地分離氟吡禾靈、氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈，前者的分離效果更優(yōu)，因此選擇ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。實驗分別以甲醇－水和乙腈－水為流動相進行分離，均不能得到良好的峰形，考慮到流動相添加劑（如乙酸銨和甲酸）可顯著改善色譜峰的分離度與靈敏度，進一步比較了甲醇－5 mmol/L 乙酸銨水溶液和0.1%甲酸乙腈－0.1%甲酸水溶液的分離效果。結果表明，以0.1%甲酸乙腈－0.1%甲酸水溶液為流動相可獲得最佳的分離度和靈敏度。在“1.2”的最佳條件下，目標物的總離子流色譜圖見圖1。由圖可知，目標物的響應強度高、無干擾，分離度高、峰形良好。

圖1 10 ng/mL混合標準工作溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Chromatogram for mixed standard solution at concentration of 10 ng/mL haloxyfop-D4：50 ng/mL

2.3 提取條件的優(yōu)化

考察了不同提取方法對復雜基質茶葉樣品的去除雜質效果以及提取和水解效果。通過向茶葉樣品中添加氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈的標準溶液評估總氟吡禾靈的轉化率。比較了以下4種常用的水解和萃取條件：①室溫渦旋30 min；②室溫渦旋30 min，40 ℃水浴恒溫30 min；③40 ℃恒溫振蕩30 min；④40 ℃超聲水解30 min。每個實驗均加入1 mL 5 mol/L NaOH進行水解和1.5 mL 2.5 mol/L H2SO4進行中和［14］。結果表明，采用方法④獲得的總氟吡禾靈轉化率最高，因此選擇樣品提取條件為40 ℃超聲水解30 min。

2.4 水解條件的選擇

氟吡禾靈酯類主要有氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈，在施用農作物后的短時間內，所有酯類均降解為氟吡禾靈［4］。當前采用堿性水解等方式將氟吡禾靈酯類、鹽及共軛物直接轉化為氟吡禾靈，測定氟吡禾靈總和，與歐盟農殘限量規(guī)定表示一致，并以氟吡禾靈酯類的轉化情況作為評價標準［13］。堿性條件有助于提高氟吡禾靈的轉化率，但過量的堿可能導致目標物分解和隨后的中和困難。選擇檸檬樣品（酸性樣品消耗最多的堿）添加0.01 mg/kg 的氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈標準溶液，考察了5 mol/L NaOH 用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL）對總氟吡禾靈轉化率的影響（圖2）。結果表明，5 mol/L NaOH 用量為2.0 mL和2.5 mL時總氟吡禾靈的轉化率較高并趨于平穩(wěn)。實驗最終確定5 mol/L NaOH 用量為2 mL，可適用于大多數類型樣品基質的水解。

圖2 不同體積堿用量對檸檬樣品中總氟吡禾靈的水解效果Fig.2 Hydrolysis efficiency for total haloxyfop with different volume alkali in lemon sample spiked at 0.01 mg/kg haloxyfop-p-methyl and haloxyfop-2-etotyl

2.5 凈化方法的優(yōu)化

基質分散固相萃取具有快速、操作簡單、吸附能力強等特點，被廣泛用于食品中農藥殘留檢測［19］。按照優(yōu)化的提取方法對添加0.01 mg/kg 氟吡禾靈標準溶液的茶葉樣品進行處理，提取液轉入2 mL 預裝有4 種不同比例吸附劑（MgSO4、C18、PSA和GCB）的微型離心管中進行凈化（圖3）。不同吸附劑的組合如下：①MgSO4150 mg 和C1825 mg；②MgSO4150 mg 和C1850 mg；③MgSO4150 mg和C18100 mg；④MgSO4150 mg、C1825 mg 和PSA 25 mg；⑤MgSO4150 mg、C1825 mg 和GCB 25 mg；⑥MgSO4150 mg、C1825 mg、PSA 25 mg 和GCB 25 mg。結果表明，組合①、②、③和⑤均可獲得滿意的回收率，而由于PSA 對目標物具有吸附作用，導致組合④和⑥的回收率下降?？紤]植物源性食品基質的復雜性，最終確定適用于廣泛基質范圍的吸附劑組合MgSO4150 mg、C1850 mg和GCB 50 mg。

圖3 不同吸附劑組合對茶葉樣品（添加0.01 mg/kg氟吡禾靈）的回收率Fig.3 Recovery of tea samples clean-up with different sorbents（spiked at 0.01 mg/kg haloxyfop）

2.6 基質效應

植物源性食品中色素、有機酸和脂肪等雜質易引起基質增強或抑制效應，研究表明基質種類、基質數量和目標物化學性質對基質效應有一定影響［20］。實驗采用不同基質代表性樣品，如茶葉（復雜基質樣品）、檸檬（高水和高酸樣品）和大米（低水和高淀粉樣品）制備基質匹配標準曲線。按照下式計算基質效應（ME）：ME=（m基質－m溶劑）/m溶劑×100%，其中m基質和m溶劑分別為基質和溶劑匹配標準曲線的斜率。結果表明，氟吡禾靈在茶葉、檸檬和大米中的基質效應較小，ME為－9.2%～－4.5%，ME低于20%其影響可忽略［21］。因此，本方法采用溶劑匹配標準曲線進行定量。

2.7 穩(wěn)定性

通過改變堿水解與酸中和的參數評估該方法的穩(wěn)定性［21］。用添加0.01 mg/kg 氟吡甲禾靈的茶葉樣品進行考察，堿水解時，將5 mol/L NaOH 的體積由2 mL改變?yōu)?.5 mL；酸中和時，將2.5 mol/L H2SO4的體積由2 mL（溶液的pH ≈4～5）改變?yōu)?.5 mL（溶液的pH ≈6～7）。結果表明，改變堿水解參數前獲得的平均回收率為94.3%，相對標準偏差（RSD，n=5）為5.6%，改變后獲得的平均回收率降至87.2%（RSD 為4.2%，n=5）；改變酸中和參數前獲得的平均回收率為94.5%（RSD 為2.5%，n=5），改變后獲得的平均回收率為98.3%（RSD為7.3%，n=5）。結果表明，堿水解5 mol/L NaOH 體積的改變對方法穩(wěn)健性的影響顯著。因此在實驗過程中應嚴格控制，以避免結果的偏離。

2.8 方法學考察

2.8.1 線性范圍 通過內標法（氟吡禾靈-D4作為內標，質量濃度為50 ng/mL）配制2.5、5.0、10、25、50 ng/mL的系列基質匹配和溶劑匹配標準工作溶液進行LC－MS/MS分析。以質量濃度為橫坐標（x，μg/L），分析物與內標的峰面積比（y）為縱坐標繪制標準曲線。結果表明，氟吡禾靈在2.5～50 ng/mL 范圍內線性關系良好，相關系數（r2）大于0.999。

2.8.2 回收率與相對標準偏差 取空白樣品，分別添加氟吡禾靈、氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈標準溶液，加標水平為0.01、0.05、0.1 mg/kg，每個水平重復5次，并根據氟吡禾靈的標準曲線以及氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈水解為氟吡禾靈的轉化系數（分子量比分別為1.04和1.20）計算最終的回收率結果。本方法同時還能監(jiān)測氟吡甲禾靈和氟吡乙禾靈水解后的殘留情況。結果表明，檸檬、柑橘、馬鈴薯、結球甘藍、甜椒、洋蔥、大米、葵花籽及茶葉9種基質的平均回收率為80.7%～114%，RSD為1.4%～11%（見表2）。

表2 空白樣品的平均回收率及相對標準偏差（n=5）Table 2 Mean recoveries and RSDs in blank samples（n=5）

2.8.3 定量下限 在歐盟（EU）No.396/2005法規(guī)［6］中，大多數植物源性食品中總氟吡禾靈的最大允許殘留限量（MRL）低至0.01 mg/kg。本方法的定量下限（LOQ）采用加標回收方法進行驗證，檸檬、柑橘、馬鈴薯、大米、茶葉等9 種樣品的LOQ 均能達到0.01 mg/kg，滿足國內外法規(guī)對總氟吡禾靈殘留限量的檢測要求。

2.9 實際樣品的檢測

應用本方法檢測檸檬、柑橘、馬鈴薯、結球甘藍、甜椒、洋蔥、大米、葵花籽、茶葉及小麥等樣品中的總氟吡禾靈殘留，結果在2批次的小麥粉樣品中檢出總氟吡禾靈，殘留量分別為0.03、0.12 mg/kg，其余樣品均未檢出。

3 結 論

本研究建立了液相色譜－串聯質譜快速分析植物源性食品中總氟吡禾靈的方法。優(yōu)化的前處理步驟可將氟吡禾靈酯類完全轉化為總氟吡禾靈；方法的線性關系良好，r2大于0.999；檸檬、柑橘、馬鈴薯、結球甘藍、甜椒、洋蔥、大米、葵花籽及茶葉9 種樣品的加標回收率為80.7%～114%，RSD 為1.4%～11%；定量下限低至0.01 mg/kg，可滿足國內外農藥殘留限量法規(guī)的要求。該方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、專一性強、準確度高的優(yōu)勢，為總氟吡禾靈殘留的日常監(jiān)控檢測提供了實用的技術手段。