鹽析輔助液液萃取/高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定漁業(yè)水體中的7種喹諾酮類抗生素

楊 霄，劉伶俐，李小玲，肖 維，陳湘藝，謝仲桂*

（1. 湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長沙 410153；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（長沙），湖南 長沙 410153）

喹諾酮類（Quinolones，QNs）抗生素是人工合成的廣譜類抗生素藥物，具有抗菌譜廣、價(jià)格低、耐藥性低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床治療、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域。該類抗生素被人和動物攝入后大部分以原藥和代謝物形式隨生物糞便和尿液排出體外，通過淋溶、滲透等多種途徑進(jìn)入地表水、地下水及土壤中，對生態(tài)系統(tǒng)造成污染［1－2］。喹諾酮類抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，其對水生動物細(xì)菌性感染具有良好的藥物動力學(xué)特性和防治效果［3］。該類抗生素施用后，只有少部分被水產(chǎn)動物吸收，大部分進(jìn)入水體、底泥等環(huán)境介質(zhì)中，不僅會刺激環(huán)境中的病原菌產(chǎn)生耐藥性，對水生生態(tài)系統(tǒng)安全產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，而且還會通過食物鏈富集作用影響人類健康［4］。

漁業(yè)水體中喹諾酮類抗生素種類繁多，含量很低（通常為ng/L 級別）［5］，對其含量進(jìn)行檢測可為水質(zhì)監(jiān)測和水體中抗生素的分布狀況、遷移規(guī)律、降解動態(tài)等研究提供技術(shù)支撐。目前，漁業(yè)水體中喹諾酮類抗生素檢測尚無國家或地方標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有的檢測方法主要為高效液相色譜法［6－7］和高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［8－9］。高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度高、特異性強(qiáng)，廣泛用于漁業(yè)水環(huán)境中的抗生素檢測。鹽析輔助液液萃?。⊿ALLE）是一種操作簡單快速、萃取效率高的前處理技術(shù)，其影響因素主要為有機(jī)萃取劑和鹽析劑，常用的萃取劑為甲醇、乙醇、乙腈等水溶性、毒性小的有機(jī)溶劑，鹽析劑為硫酸鎂、氯化鈉、硫酸銨、氯化銨、甲酸銨、乙酸銨等環(huán)境友好的鹽類。目前，SALLE在蜂蜜、血漿、白酒、水產(chǎn)品、嬰幼兒食品、魚類和肉類等樣品的有毒有害物質(zhì)殘留檢測中應(yīng)用較多［10－15］，但在環(huán)境水體中農(nóng)藥［16－17］和抗生素［18］檢測中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。Gezahegn 等［18］建立了一種以硫酸鎂輔助乙腈鹽析萃取結(jié)合高效液相色譜測定環(huán)境水體中環(huán)丙沙星的分析方法。該方法的線性范圍寬、回收率高、操作簡便快速、環(huán)境友好，在環(huán)境水體中抗生素殘留檢測方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本文以乙腈為萃取劑，硫酸鎂為鹽析劑，采用SALLE 技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS），建立了一種簡單、快速、高效測定漁業(yè)水體中環(huán)丙沙星等7種喹諾酮類抗生素的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access 高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）；旋渦混勻儀（美國Scilogex 公司）；氮吹儀（美國Organomation 公司）；AB135－S 精密電子天平（梅特勒－托利多公司）；超純水儀（中沃水務(wù)環(huán)保科技有限公司）。

甲醇、乙腈（HPLC 級，i國Merck 公司）；甲酸（LC－MS 級，美國Sigma 公司）；丙酮（HPLC 級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸銨（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化鈉（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）；硫酸鎂、鹽酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.25 MΩ·cm）。

環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）、培氟沙星（PEF）、諾氟沙星（NOR）、洛美沙星（LOM）、氟羅沙星（FLE）標(biāo)準(zhǔn)品均購自i國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg），用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20 ℃避光保存。實(shí)驗(yàn)時，將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液以20%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品處理

量取10 mL 水樣至50 mL 離心管中，用稀鹽酸調(diào)至pH 3.0 ± 0.05，加入5.0 mL 乙腈，渦旋混勻30 s。再加入3.5 g 硫酸鎂，渦旋混勻5 min 使其充分溶解，以6 000 r/min 離心5 min，使樣品溶液與乙腈相完全分層。將上層有機(jī)相全部轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，40 ℃氮?dú)獯抵两?，加?.50 mL 20%甲醇水溶液，渦旋混勻30 s，過0.22 μm濾膜，濾液待測定。

1.4 色譜－質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 Waters Atlantis C18色譜柱（150 mm × 2.1 mm，3.0 μm）；柱溫為30 ℃；流速為0.25 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；流動相：A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～9.0 min，20%～80% B；9.0～11.0 min，80% B；11.0～12.0 min，80%～20% B；12.0～13.0 min，20%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子模式，選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；噴霧電壓為3 500 V；離子傳輸毛細(xì)管溫度為300 ℃；蒸發(fā)溫度為350 ℃；鞘氣壓力為40 Arb，輔助氣壓力為10 Arb，碰撞氣壓力為199.983 MPa。優(yōu)化后的其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 7種喹諾酮的色譜保留時間與質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters for seven quinolones

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用的Waters Atlantis C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.0 μm）具有柱內(nèi)徑和填料粒徑小、分離度高等特點(diǎn)，是HPLC 分離中的通用型色譜柱，適用于多種藥物殘留分析。喹諾酮類化合物在甲醇－水體系中的響應(yīng)值較高，在水相中加入0.1%甲酸可改善目標(biāo)物峰形，提高目標(biāo)物的離子化效率?？紤]到目標(biāo)分析物的化學(xué)性質(zhì)差異較大，采用梯度洗脫程序可有效縮短分析時間，并去除樣品溶液中殘留的雜質(zhì)。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇－0.1%甲酸水溶液作為流動相，采用“1.4.1”的梯度洗脫程序進(jìn)行檢測。7 種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg/L）的SRM色譜圖見圖1。

圖1 7種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg/L）的SRM色譜圖Fig.1 SRM chromatograms of the seven quinolones standard solution（5 μg/L）

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

喹諾酮類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有羰基等富電子基團(tuán)，易在電噴霧離子源正離子模式（ESI+）下產(chǎn)生［M+H］+分子離子。采用流動注射進(jìn)樣方式，以10 μL/min的流速將500 μg/L的7種喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中。在正離子模式下分別對單個喹諾酮類藥物進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，獲得目標(biāo)物的分子離子峰（［M+H］+），選取各化合物的［M+H］+為母離子，優(yōu)化噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力、離子傳輸毛細(xì)管溫度等參數(shù)。然后利用二級質(zhì)譜全掃描收集各藥物母離子對應(yīng)的子離子信息，分別選取相對豐度最強(qiáng)和次強(qiáng)的子離子作為定量離子和定性離子，并優(yōu)化碰撞能。最終確定的質(zhì)譜條件如“1.4.2”所述。

2.3 SALLE方法的優(yōu)化

2.3.1 水樣pH值的影響 喹諾酮類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羧基和叔胺基官能團(tuán)，屬于兩性、極性化合物。對于可電離的極性化合物而言，樣品溶液的pH值直接影響待測物的電離狀態(tài)和溶解性，從而對其萃取效率產(chǎn)生重要影響［18－19］。實(shí)驗(yàn)考察了不同pH值對目標(biāo)物萃取效率的影響。以空白水樣為基底，用稀鹽酸分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，然后加入10 μg/L 的喹諾酮類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后按照“1.3”方法進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH 3.0時目標(biāo)化合物的回收率較高，重現(xiàn)性較好。因此，實(shí)驗(yàn)選擇水樣pH值為3.0。

2.3.2 萃取劑的優(yōu)化 萃取劑是影響萃取率的關(guān)鍵因素。SALLE 的萃取劑一般需滿足以下條件：①密度小于水且可與水混溶；②對目標(biāo)物的萃取能力強(qiáng)；③加入鹽析劑后，樣品溶液與萃取劑分層良好，便于收集萃取劑層。實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、甲醇和丙酮3 種與水互溶的常用有機(jī)溶劑的萃取性能。結(jié)果表明，加入鹽析劑硫酸鎂后，乙腈與樣品溶液分層良好且鹽析劑完全溶解，而甲醇和丙酮與樣品溶液未出現(xiàn)明顯分層且鹽析劑溶解不完全。因此，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為萃取劑。

同時考察了不同體積（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL）的萃取劑乙腈對萃取劑與樣品溶液分層效果和目標(biāo)物回收率的影響（見圖2）。結(jié)果表明：萃取分層后乙腈相的體積隨著乙腈用量的增加而增大。當(dāng)乙腈用量為1.0～5.0 mL 時，目標(biāo)物的萃取回收率隨著乙腈體積的增加而逐漸增大，當(dāng)乙腈用量大于5.0 mL 時，目標(biāo)物的回收率隨著乙腈體積的增加幾乎不變。為節(jié)省有機(jī)溶劑和縮短分析時間，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈的體積為5.0 mL。

圖2 萃取劑體積對7種喹諾酮回收率的影響（n=3）Fig.2 Effect of the extraction solvent volume on the recoveries of seven quinolones（n=3）

2.3.3 鹽析劑的優(yōu)化 鹽析劑是影響萃取率的重要因素。SALLE 的鹽析劑一般需滿足以下要求：①鹽析劑難溶于萃取劑（提取溶劑）；②鹽析劑在水中的溶解度足夠大，以使鹽析作用最大化?？疾炝?種常見的鹽析劑（硫酸鎂、硫酸銨、氯化鈉和甲酸銨）對目標(biāo)化合物的萃取效率。結(jié)果表明，硫酸鎂作為鹽析劑時，萃取劑和鹽析劑的分層效果最好，目標(biāo)物的萃取回收率最高，這可能是由于鎂離子的離子電位高，鹽析作用更強(qiáng)，能更好地提高SALLE 的萃取效率［20］。因此，實(shí)驗(yàn)選擇硫酸鎂作為鹽析劑。進(jìn)一步考察了硫酸鎂的用量（1.5、2.5、3.5、4.0、4.5 g）對SALLE 富集效應(yīng)和萃取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硫酸鎂的用量在1.5～3.5 g 遞增時，萃取后乙腈相的體積增大，目標(biāo)物的萃取回收率增加；當(dāng)硫酸鎂的用量在3.5～4.5 g 遞增時，萃取后乙腈相的體積變化不大，目標(biāo)物的萃取回收率幾乎不變。因此，實(shí)驗(yàn)選擇硫酸鎂的用量為3.5 g。

2.3.4 渦旋混合時間的影響 渦旋混合影響目標(biāo)物的萃取動力學(xué)過程。一方面，渦旋混合可加速鹽析劑在水相的溶解；另一方面，渦旋混合增強(qiáng)了乙腈與水溶液間的接觸，有利于兩相體系的形成［16］。傳質(zhì)是一個與時間有關(guān)的過程，因此渦旋混合時間對目標(biāo)物的萃取效率有重要影響［18］。實(shí)驗(yàn)考察了渦旋混合時間為1～9 min時對目標(biāo)物萃取回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)渦旋混合時間為5 min時，鹽析劑在水相中溶解完全，各目標(biāo)化合物的回收率均較高。因此，選擇最佳的渦旋混合時間為5 min。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

用初始流動相將喹諾酮類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 mg/L）稀釋配制成6個濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照優(yōu)化后的儀器條件進(jìn)行測定。采用外標(biāo)法定量，以待測組分的質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用在空白水樣中添加低濃度目標(biāo)組分的方法，以信噪比S/N=3和S/N=10分別確定各組分的檢出限和定量下限。結(jié)果表明，7種喹諾酮類抗生素在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.995，方法的LOD 和LOQ 分別為3～10 ng/L 和10～25 ng/L（見表2）。

表2 7種喹諾酮藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r2），limits of detection（LOD）and limits of quantitation（LOQ）of seven quinolones

2.5 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在空白水樣中分別添加3個不同濃度水平的喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個水平重復(fù)測定6 次，結(jié)果如表3 所示。7 種喹諾酮的平均回收率為77.8%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.1%～10%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度好，滿足漁業(yè)水體中喹諾酮類抗生素的檢測要求。

表3 空白樣品添加7種喹諾酮的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of seven quinolones spiked in blank samples（n=6）

2.6 與其他方法的比較

表4為本方法與國內(nèi)外已報(bào)道的水體中喹諾酮類藥物檢測方法的比較。由表4可知，本方法具有線性范圍寬、檢出限低和回收率高等優(yōu)點(diǎn)。更為重要的是，本方法的水樣取樣量少，萃取劑毒性低且用量更少，對環(huán)境更友好。這表明本方法具有較好的應(yīng)用前景，可作為一種簡便、快速、高效檢測水體中痕量喹諾酮類抗生素殘留的新方法。

表4 本方法與其他檢測水體中喹諾酮類藥物方法的對比Table 4 Comparison of the proposed method with other reported methods for determination of quinolones in water samples

2.7 實(shí)際樣品檢測

為驗(yàn)證方法的可靠性和實(shí)用性，采用優(yōu)化的前處理方法和儀器條件對湖南省某市抽取的池塘水、湖泊水和水庫水共20 份水樣進(jìn)行分析。結(jié)果表明，有4 份水樣檢出恩諾沙星（質(zhì)量濃度為10.6～35.2 ng/L），1份水樣檢出氧氟沙星（質(zhì)量濃度為13.8 ng/L）。

3 結(jié) 論

本文采用SALLE和HPLC－MS/MS技術(shù)，建立了一種同時測定漁業(yè)水體中7種喹諾酮類抗生素的分析方法。該方法靈敏度高、選擇性好，操作簡便快速。將此方法應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測，結(jié)果表明，部分漁業(yè)水體受到抗生素的污染。