基于脂肪酸含量分析結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的橄欖油等級鑒別方法

曾 靜，伊雄海，曲 栗，2，郭德華，包 明，張 怡，陳玨穎

（1. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135；2. 復(fù)旦大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200433）

橄欖油在地中海國家是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的產(chǎn)品，在國際上因其具有豐富的脂肪酸，易被人體吸收，具有調(diào)節(jié)膽固醇、抗氧化、預(yù)防癌癥、美容等功效而備受人們的青睞［1－2］。特級初榨橄欖油被認(rèn)為是橄欖油的最高品質(zhì)等級，其營養(yǎng)特殊、風(fēng)味獨(dú)特且具有保健功能，因此價(jià)格昂貴。但在利益的驅(qū)使下，一些不法商家以次充好，將非初榨橄欖油（如精煉橄欖油）冒充特級初榨橄欖油，或摻入其他種類的植物油或油橄欖果渣油，重新勾兌后冒充橄欖油，嚴(yán)重影響了消費(fèi)者的健康［3－4］。

目前橄欖油摻偽鑒別主要以甾醇、脂肪酸、揮發(fā)性物質(zhì)、蠟含量為目標(biāo)物進(jìn)行檢測［5－11］，如Yang等［6］通過測定食用油中脂肪酸含量，成功地鑒別出摻有4種植物油的特級初榨橄欖油，張方圓等［12］采用氣相色譜法測定食用油中脂肪酸含量，成功對6種食用油進(jìn)行分類，Jabeur等［13］利用氣相色譜法結(jié)合線性判別分析方法通過測定亞麻酸和反式脂肪酸含量完成橄欖油摻假的定性和定量研究，但這些研究報(bào)道僅針對于橄欖油中摻雜其他植物油，而未對特級初榨橄欖油和低等級橄欖油的等級鑒別進(jìn)行相關(guān)研究。此外，Torrecilia 等［2］采用紫外檢測結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)成功鑒別特級初榨橄欖油中摻假低等級橄欖油（精煉橄欖油、油橄欖果渣油），Quintanilla－Casas 等［14］將化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合頂空固相微萃?。℉SAPME）和氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）測定橄欖油中揮發(fā)性物質(zhì)，Mustorgi等［15］建立了化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合近紅外光譜法測定特級初榨橄欖油品質(zhì)的預(yù)測模型；婁婷婷等［17］建立了多種光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對食用油的分析鑒別方法，但這些光譜法只能給出整個指紋特征的相關(guān)信息，而不能得到其具體組成部分的信息。因此，建立一種基于橄欖油中特征組分鑒別特級初榨橄欖油和低等級橄欖油的方法具有重要意義。

化學(xué)計(jì)量學(xué)包括主成分分析（PCA）、k 鄰近（kNN）線性判別分析、偏最小二乘判別分析（PLSDA）、聚類分析（HCA）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)方法不僅可降低數(shù)據(jù)維度，而且有助于對測量數(shù)據(jù)的解釋、判別和預(yù)測［16］。近年來，隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)外將化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合色譜、光譜等方法用于鑒別橄欖油真?zhèn)蔚难芯吭絹碓蕉啵纾喉n建勛等［18］建立了傅里葉變換紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)用于山茶油中摻雜大豆油的鑒別；相倩倩等［19］建立了光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)鑒別蜂蜜的真?zhèn)巍?/p>

本文采用測定脂肪酸含量結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)法對特級初榨橄欖油和精煉橄欖油進(jìn)行等級鑒別，應(yīng)用氣相色譜法（GC）分別測定初榨橄欖油和精煉橄欖油中的脂肪酸含量，通過主成分分析、聚類分析、偏最小二乘判別分析建立了橄欖油等級鑒別預(yù)測模型。本方法的建立彌補(bǔ)了現(xiàn)有研究中對特級初榨橄欖油和低等級橄欖油鑒別的缺乏，同時也解決了指紋圖譜中僅獲得整個指紋特征相關(guān)信息，而得不到具體組成部分信息的缺陷。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent7890A 氣相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Vortex2 渦旋混合器（i國IKA 公司）；Allegia X－22R 高速冷凍離心機(jī)（Beckman 公司）；恒溫水浴鍋（歐萊博公司）；0.22 μm 有機(jī)相濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；Million－Q Integral型超純水系統(tǒng)（i國默克公司）。

37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品（10 mg/mL，產(chǎn)品編號：47885－U，美國Supelco 公司）。甲醇、正己烷（色譜純，美國Merk公司）；氫氧化鉀（分析純，國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司）。4 mol/L氫氧化鉀－甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取112 g氫氧化鉀，用甲醇定容至500 mL，臨用時現(xiàn)配。

實(shí)驗(yàn)樣品主要包括16 種特級初榨橄欖油（EVOO）、26 種精煉橄欖油（ROO），均收集于進(jìn)口及國外各橄欖油企業(yè)，經(jīng)相關(guān)機(jī)構(gòu)認(rèn)定及實(shí)驗(yàn)證明其真實(shí)屬性，這42種確認(rèn)屬性樣品作為訓(xùn)練集，樣品編號及真實(shí)屬性等信息見表1。98 種未知屬性的橄欖油樣品作為測試集，用于驗(yàn)證模型的可靠性，包括72個特級初榨橄欖油樣品和26個精煉橄欖油樣品。

表1 橄欖油樣品的信息Table 1 Information of olive oil samples

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酸甲酯的測定 準(zhǔn)確稱取0.1 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL具塞試管，加入5 mL正己烷，渦旋振蕩1 min，加入200 μL 4 mol/L氫氧化鉀－甲醇溶液，劇烈振搖30 s，靜置澄清后，加入10 mL去離子水，振搖，于4 000 r/min下離心5 min，取上層清液，過膜，待GC－FID分析測定。

1.2.2 儀器條件 色譜條件：色譜柱（氰丙基聚硅氧烷強(qiáng)極性固定相）：SP－2560 色譜柱（100 m ×0.25 mm，0.2 μm，Supelco 公司）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；檢測器溫度：280 ℃；程度升溫：100 ℃（保持3 min），以10 ℃/min 升至180 ℃（保持3 min），以1 ℃/min 升至200 ℃（保持10 min），以4 ℃/min 升至230 ℃（保持5 min）。進(jìn)樣體積：1 μL；分流比：100∶1，載氣：氮?dú)狻?/p>

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 采用Metaboanalyst5.0 軟件對測得數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、PCA、HCA和PLS－DA分析，并通過交叉驗(yàn)證方式驗(yàn)證模型的可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

比較了DB－WAX（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）、HP－88（100 m × 0.25 mm，0.2 μm）和SP－2560（100 m×0.25 mm，0.2 μm）3種色譜柱對37種脂肪酸甲酯的分離效果。結(jié)果表明，DB－WAX色譜柱對順反式異構(gòu)體的分離效果差，有4 組化合物（C18∶ln9c/C18∶ln9t；C18∶2n6c/C18∶2n6t；C20∶3n6/C21∶0；C22∶6/C24∶1）共流出，表明此色譜柱不適用于復(fù)雜橄欖油樣品中脂肪酸甲酯的分離；HP－88色譜柱能夠很好地分離順反式異構(gòu)體，但有1組化合物（C22∶0/C20∶3n6）共流出，表明此色譜柱對復(fù)雜樣品（如氫化植物油）有較好的分離效果，也適用于橄欖油樣品；SP－2560（100 m × 0.25 mm，0.2 μm）是一種強(qiáng)極性的色譜柱，其固定相成分為100%氰丙基聚硅氧烷，此色譜柱能夠很好地分離37種脂肪酸甲酯，且無化合物共流出現(xiàn)象，適合橄欖油樣品中脂肪酸甲酯的分離，本實(shí)驗(yàn)選用SP－2560色譜柱進(jìn)行分離。圖1為37種脂肪酸甲酯在SP－2560色譜柱上的分離情況。

圖1 37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 37 mix fatty acids methyl ester standard

2.2 兩種等級橄欖油中脂肪酸甲酯含量的測定

分別對確認(rèn)屬性的42 個橄欖油樣品進(jìn)行脂肪酸甲酯含量的測定，共測出37 種脂肪酸甲酯，其中22種脂肪酸甲酯含量小于檢出限。表2給出了含量大于檢出限的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，由表可知，除C18∶2n6t 外，其余脂肪酸在兩種等級的橄欖油中含量相差不大，一般的統(tǒng)計(jì)分析方法很難對兩種等級橄欖油進(jìn)行鑒別。而C18∶2n6t 在特級初榨橄欖油中均未檢出，在部分精煉橄欖油中未檢出（如：編號64、70、213 均未檢出C18∶2n6t），其原因除了受加工過程的影響外，橄欖油的產(chǎn)地也可能是影響因素。因此，不能只以該脂肪酸作為鑒別特級初榨橄欖油和精煉橄欖油等級的指標(biāo)，還需結(jié)合其他具有差異性的特征指標(biāo)鑒別兩種等級橄欖油。

表2 兩種等級橄欖油中各脂肪酸甲酯的含量（%）Table 2 Contents of fatty acid methyl ester in two grades of olive oils（%）

2.3 鑒別兩種等級橄欖油的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.3.1 主成分分析（PCA） PCA 是一種無監(jiān)督的模式識別方法，通過對錯綜復(fù)雜的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，篩選能重現(xiàn)的數(shù)據(jù)信息，并以幾個主成分的形式對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，以集中典型地表征原變量的數(shù)據(jù)特征，從而充分反映總體信息［20－21］，目的是尋找最能解釋數(shù)據(jù)集（X）中方差的方向，而不需要參考類別標(biāo)簽（Y）。本文采用Metaboanalyst5.0軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后，進(jìn)行主成分分析。特級初榨橄欖油和精煉橄欖油的PCA結(jié)果如圖2所示。A和B表示經(jīng)兩種不同預(yù)處理方式（A：各變量最小正值的1/5 替換缺失值；B：各變量最小正值的1/5 替換缺失值后，進(jìn)行歸一化處理）得到的PCA 得分圖。由圖可知，未經(jīng)歸一化預(yù)處理的數(shù)據(jù)，得到的PCA 圖中兩種等級橄欖油的主成分存在重疊現(xiàn)象，不能很好地分開，而經(jīng)歸一化處理后得到的PCA 圖中，特級初榨橄欖油和精煉橄欖油各聚為一類，具有明顯的聚集區(qū)域，其中第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為58.5%和14.9%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為73.4%。這是由于歸一化處理使得同一樣品不同屬性間或同一屬性間在不同樣品內(nèi)的方差減小。因此，本方法采用對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化預(yù)處理后再進(jìn)行主成分分析。

圖2 兩種等級橄欖油的PCA得分圖Fig.2 PCA score plots for grade identification of two kinds of olive oils

圖3為經(jīng)歸一化預(yù)處理后得到的兩種等級橄欖油的PCA 載荷圖，由圖可知，C23∶0（14）、C18∶2n6t（8）、C24∶0（15）等組分的載荷圖與圖2B 中精煉橄欖油所處位置相似，表明其在精煉橄欖油中的含量高于特級初榨橄欖油。C18∶1/C18∶2（18）、C20∶1（11）、C18∶1n9c（7）等組分的載荷圖與圖2B中特級初榨橄欖油位置相似，因此這些脂肪酸在特級初榨橄欖油中的含量較高，這與表2結(jié)果一致。

圖3 兩種等級橄欖油的PCA載荷圖Fig.3 PCA load chart for grade identification of two kinds of olive oils

2.3.2 聚類分析（HCA） HCA是依據(jù)觀察對象的某些特征加以歸類的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法。本研究將原始數(shù)據(jù)經(jīng)過缺失值替換，并作歸一化處理后進(jìn)行聚類分析，得到熱圖（見圖4）。圖中每行代表一種化合物，含量從低到高由藍(lán)色到紅色，兩種等級橄欖油被清晰的分成兩組，且分類正確。因此，可采用HCA 方法區(qū)分特級初榨橄欖油和精煉橄欖油。

圖4 兩種等級橄欖油脂肪酸的聚類分析熱圖Fig.4 Cluster analysis heat map of two grades of olive oils based on fatty acids

2.3.3 偏最小二乘法判別分析（PLS－DA） PLS－DA是一種有監(jiān)督的識別方法，因其所建的模型比較穩(wěn)定，且具有很強(qiáng)的抗干擾能力，因此是目前應(yīng)用最為廣泛的定量建模方法。圖5 為兩種等級橄欖油的PLS－DA 二維模型，由圖可知，PLS－DA 模型的分類結(jié)果與PCA 分析結(jié)果類似，樣品組內(nèi)得到較好的聚類效果，能清晰明確地對特級初榨橄欖油和精煉橄欖油進(jìn)行分類。圖6 是變量權(quán)重的重要性排序（VIP）圖，其中VIP值越大，說明該變量對分類的貢獻(xiàn)越大，通常選擇VIP值大于1的變量，由圖6知，C23∶0、C18∶2n6t、C24∶0、C18∶1/C18∶2、C20∶1和C18∶1n9c對模型的貢獻(xiàn)較大。

圖5 兩種等級橄欖油的PLS－DA模型圖Fig.5 PLS－DA models of two grades of olive oils based on fatty acids

圖6 PLS－DA模型的VIP值Fig.6 VIP value of PLS－DA model

由于PLS－DA 是一種有監(jiān)督的模式判別方法，易出現(xiàn)過度擬合風(fēng)險(xiǎn)，因此，需對建立的模型進(jìn)行交叉驗(yàn)證（Cross validation，CV）。交叉驗(yàn)證中，可預(yù)測指標(biāo)（Q2）用于估計(jì)模型的預(yù)測能力，Q2值越接近1，說明模型的預(yù)測能力越好。本方法采用98 個橄欖油樣品作為驗(yàn)證集對建立的模型進(jìn)行交叉驗(yàn)證。表3 和圖7 給出了以十折交叉驗(yàn)證（CV）得到的模型驗(yàn)證結(jié)果。從圖7 可知，前5 個組分（C23∶0、C18∶2n6t、C24∶0、C18∶1/C18∶2、C20∶1）模型的相關(guān)系數(shù)（R2）在0.96 ～0.99之間，Q2在0.96 ～0.97之間。由表3可知，特級初榨橄欖油（EVOO）的預(yù)測準(zhǔn)確率為97.2%，精煉橄欖油（ROO）的預(yù)測準(zhǔn)確率為100%。綜上可知，本方法所建立的預(yù)測模型可靠性較高。

圖7 PLS－DA模型的十折交叉驗(yàn)證結(jié)果Fig.7 10 times cross validation results of PLS－DA model

表3 PLS－DA模型的交叉驗(yàn)證結(jié)果Table 3 Cross validation result of PLS－DA model

3 結(jié) 論

本文通過GC 法測定橄欖油中脂肪酸含量，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)法，有效地區(qū)分了特級初榨橄欖油和精煉橄欖油。原始數(shù)據(jù)經(jīng)空值替換后經(jīng)歸一化處理得到的PCA 得分圖效果明顯優(yōu)于未經(jīng)歸一化處理得到的PCA 效果；同時對歸一化處理的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行了PCA、HCA 和PLS－DA 3 種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的分析。結(jié)果表明，該3種方法均能有效地對兩種等級橄欖油進(jìn)行正確分類；通過VIP值，最終確認(rèn)C23∶0、C18∶2n6t、C24∶0、C18∶1/C18∶2、C20∶1和C18∶1n9c等6種組分作為兩種橄欖油等級鑒別的特征組分。經(jīng)交叉驗(yàn)證，建立的PLS－DA 模型具有較好的預(yù)測能力。結(jié)果表明，基于脂肪酸含量分析結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)法可作為鑒別兩種等級橄欖油的有效手段，為橄欖油的真實(shí)性鑒別提供了理論和科學(xué)依據(jù)。