在線固相萃取－同位素稀釋/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中26種喹諾酮類化合物

張居舟，李 靜

（1. 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051；2. 國家農(nóng)副加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心，安徽 合肥 230051）

喹諾酮類藥物為人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，可作用于細(xì)菌的脫氧核糖核酸的回旋酶，使細(xì)胞無法分裂，從而起到抗菌效果［1］。該類藥物目前已發(fā)展到第五代，為人畜共用，可預(yù)防不同種類動物的疾病。喹諾酮類藥物可防治蜜蜂的腐臭病、敗血病等，然而藥物濫用致使其在蜂產(chǎn)品中殘留。人類若長期食用含有喹諾酮類藥物的食品，會誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性；若過量食用此類藥物，還會出現(xiàn)惡心、腹瀉、頭痛、眩暈，以及白細(xì)胞減少、肝損傷等不良反應(yīng)，有致畸、致突變的潛在風(fēng)險［2－3］。因此，國內(nèi)外對食品中喹諾酮的含量均進(jìn)行嚴(yán)格限定。我國規(guī)定，恩諾沙星、達(dá)氟沙星、雙氟沙星和沙拉沙星在家禽產(chǎn)蛋期禁用，并規(guī)定了其他動物源食品中的最大殘留限量［4］；洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星在食品動物中禁用［5］。歐盟規(guī)定了麻保沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹和噁喹酸的最大殘留限量，此類抗生素藥物也未被授權(quán)用于治療蜜蜂［6］。為規(guī)避市場監(jiān)管，仍有企業(yè)非法使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定之外的喹諾酮類抗生素，然而新一代喹諾酮類藥物的檢測方法尚未建立。因此，迫切需要開發(fā)一種能同時測定蜂蜜中目前上市的所有喹諾酮類藥物的檢測方法，進(jìn)而為監(jiān)管部門及蜂蜜進(jìn)出口貿(mào)易提供技術(shù)支持。

目前，蜂蜜中喹諾酮類藥物的檢測方法有薄層色譜法［7］、高效液相色譜法（HPLC）［8－9］、高效液相色譜－質(zhì)譜/質(zhì)譜法（HPLC－MS/MS）［10－16］等，其中薄層色譜法適用于定性分析，HPLC 法的定性易受假陽性干擾，HPLC－MS/MS法集多組分的定性、定量和高效分離于一體，應(yīng)用最為廣泛。喹諾酮類藥物結(jié)構(gòu)相似，且存在同分異構(gòu)體，文獻(xiàn)報道的前處理方法有經(jīng)典固相萃?。?0，14］、分子印跡固相萃?。?6］、磁性多壁碳納米管固相萃?。?5］、光纖固相微萃取［11］和QuEChERS［8，12］等，然而針對蜂蜜基質(zhì)，上述方法均有各自的優(yōu)勢和不足。本文應(yīng)用在線固相萃取技術(shù)，提升了前處理效率，采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜的動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（dMRM）模式，系統(tǒng)自動分配掃描時間，駐留時間更長，明顯提高了靈敏度，適合高通量快速分析；檢測26種目標(biāo)物，較文獻(xiàn)［10］和國標(biāo)［17－18］方法新增了尚未報道的那氟沙星、妥蘇沙星、克林沙星、莫西沙星、吉米沙星和巴洛沙星6 種藥物，可以滿足蜂蜜中喹諾酮類化合物高通量快速篩查和食品安全應(yīng)急檢驗(yàn)的需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 超高效液相色譜儀、6495 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源，美國Agilent 公司），GX－271 ASPEC 全自動固相萃取儀（美國Gilson 公司），IKA MS3 Basic 型渦旋振蕩器（i國IKA 公司）。Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（200 mg/6 mL，美國Waters公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：克林沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL，美國A ChemTek 公司）；加替沙星（純度98.5%）、鹽酸莫西沙星（純度99.8%）購于美國CATO 公司；吉米沙星（純度97%）、巴洛沙星（純度98%）、鹽酸妥蘇沙星（純度97%）購于加拿大TRC 公司；那氟沙星（純度97.6%）購于i國Dr. Ehrenstorfer 公司；其余19 種喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）購于美國A ChemTek 公司。內(nèi)標(biāo)：恩諾沙星－D5、諾氟沙星－D5、氧氟沙星－D3（i國Dr. Ehrenstorfer 公司）；環(huán)丙沙星－D8、培氟沙星－D5、沙拉沙星－D8、依諾沙星－D8、雙氟沙星－D3購于北京Manhage生物科技公司；氟羅沙星－D3、洛美沙星－D5、達(dá)氟沙星－D3、氟甲喹－13C3（美國A ChemTek公司），加替沙星－D4、莫西沙星－13CD3購于加拿大TRC公司，噁喹酸－D5購于上海ANPEL公司。

甲醇、乙腈（LC－MS 級）購于i國Merck 公司；甲酸（色譜純）購于美國ACS 公司；實(shí)驗(yàn)用水由Milli－Q超純水機(jī)制備。

樣品：洋槐蜜、棗花蜜、荊條蜜、油菜花蜜、紫云英蜜、枸杞蜜、枇杷蜜、百花蜜、櫻花蜜均為本地市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg（精確至0.01 mg）加替沙星、莫西沙星、吉米沙星、巴洛沙星、妥蘇沙星、那氟沙星固體標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的6種混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再分別吸取1 mL克林沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液、6種混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液、其余19 種喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL 容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的26種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于－18 ℃下避光儲存。

同位素內(nèi)標(biāo)混合溶液：使用甲醇－水溶液（體積比3∶1，諾氟沙星－D5、培氟沙星－D5溶液分別加2 滴鹽酸助溶）分別配制100 μg/mL 的各單標(biāo)儲備液。再用甲醇稀釋成1 μg/mL 的15 種混合內(nèi)標(biāo)溶液，于－18 ℃下避光儲存。

分別精密量取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及同位素內(nèi)標(biāo)混合溶液適量，用1%甲酸溶液－甲醇（體積比10∶90）稀釋成0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度均為10 μg/L。

1.2.2 樣品前處理 稱取2 g（精確至0.001 g）蜂蜜于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入100 μL 1 mg/L混合內(nèi)標(biāo)溶液和10.0 mL 1%甲酸溶液－甲醇（10∶90），渦旋混合至樣品溶解，10 000 r/min 離心3 min。將PRiME HLB 小柱置于全自動固相萃取儀萃取架上，調(diào)節(jié)流速為1 mL/min，吸取2 mL提取液過柱，收集流出液，過0.22 μm濾膜至樣品瓶，待分析。

1.2.3 色譜參數(shù) 色譜柱：Agilent Eclipse Plus RRHD C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動相：A 為0.1%甲酸溶液，B 為乙腈；線性梯度洗脫程序：0～1.0 min，95% A；1.0～2.0 min，95%～90% A；2.0～3.0 min，90%～87% A；3.0～5.0 min，87%～85% A；5.0～7.0 min，85%～35% A；7.0～8.0 min，35%～10% A；8.0～9.0 min，10% A；9.0～11.0 min，10%～95% A。流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL。

1.2.4 質(zhì)譜參數(shù) 離子源：電噴霧離子源（AJS ESI）；監(jiān)測方式：dMRM；掃描模式：正離子掃描；干燥氣溫度：220 ℃；干燥氣流速：17 L/min；霧化氣壓力：2.1×105Pa；鞘氣溫度：340 ℃；鞘氣流速：11 L/min；毛細(xì)管電壓：3 000 V；噴嘴電壓：400 V；碰撞池加速電壓：5 V；碎裂電壓：380 V；其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 26種喹諾酮類化合物及15種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of the 26 quinolones and 15 internal standards

（續(xù)表1）

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

喹諾酮類化合物結(jié)構(gòu)含有哌嗪環(huán)、羧基或喹啉環(huán)，其［M+H］+峰響應(yīng)強(qiáng)度均較大，因此選擇［M+H］+作為分子離子峰。使用電噴霧離子源，正離子模式（ESI+），在m/z100～500 范圍內(nèi)對母離子進(jìn)行全掃描，比較各化合物的母離子響應(yīng)強(qiáng)度，依次優(yōu)化毛細(xì)管電壓、干燥氣溫度、干燥氣流速、霧化氣壓力、鞘氣溫度、鞘氣流速和噴嘴電壓；再分別進(jìn)行子離子掃描，子離子主要為脫羧峰［M +H－CO2］+和脫羧后哌嗪環(huán)斷裂重排峰［M+H－CO2－C2H4NR］+［10］，在優(yōu)化碰撞能及碰撞池加速電壓后，形成多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方法，進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，在MRM 方法數(shù)據(jù)或圖譜的基礎(chǔ)上升級形成dMRM方法，每個化合物的保留時間窗口自動進(jìn)行動態(tài)分配，靈敏度和峰形均有不同程度的改善。值得注意的是，氟甲喹和噁喹酸、恩諾沙星－D5和氧氟沙星－D3互為同分異構(gòu)體，具有相同的母離子和碎片離子信息，需分別優(yōu)化其單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液以確定各離子對的碰撞能，并通過各同分異構(gòu)體在色譜柱上保留時間的差異，設(shè)置保留時間窗對峰進(jìn)行定位。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

喹諾酮類化合物結(jié)構(gòu)含有親油親水兩性基團(tuán)，極性存在一定差異，實(shí)驗(yàn)分別選擇Agilent Eclipse Plus RRHD C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Agilent Eclipse Plus RRHD C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）和Waters BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行分析，為避免在反向色譜柱上出現(xiàn)色譜峰拖尾現(xiàn)象，選擇0.1%甲酸溶液－乙腈為流動相，依次優(yōu)化流動相的初始比、梯度洗脫曲線斜率和洗脫時間。結(jié)果表明，0.1%甲酸溶液不僅可為正離子掃描提供質(zhì)子，提高離子化效率，且提高了峰的對稱性；C18色譜柱較HILIC 色譜柱的分離效果更佳。隨著洗脫曲線斜率的變小，洗脫時間的延長，各化合物被洗脫的速率變緩，可將互為同分異構(gòu)體的氟甲喹和噁喹酸、恩諾沙星－D5和氧氟沙星－D3完全分離，26 種化合物的靈敏度和分辨率均滿足要求。在優(yōu)化的梯度洗脫程序下，由于100 mm 長度的C18和HILIC 色譜柱需更長的分離時間，且分離效果和峰靈敏度均比50 mm 長度的色譜柱差，因此實(shí)驗(yàn)采用50 mm的Agilent Eclipse Plus RRHD C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱，目標(biāo)化合物的分離效果良好（如圖1）。

圖1 26種喹諾酮類化合物（2.0 μg/L）及15種內(nèi)標(biāo)（10 μg/L）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of 26 quinolones（2.0 μg/L）and 15 internal standards（10 μg/L）the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.3 提取條件的選擇

喹諾酮類化合物中含有叔氨基和羧基，溶于堿性或酸性溶液，可使用酸性或堿性溶液混合有機(jī)溶劑提取。實(shí)驗(yàn)對1%甲酸溶液－乙腈（5∶95）、1%甲酸溶液－甲醇（5∶95）、氨水－甲醇（5∶95）的提取效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，1%甲酸溶液－乙腈（5∶95）的提取液有少量白色沉淀，26 種待測物的回收率為65%～115%，其中氟羅沙星、克林沙星的回收率低于70%；1%甲酸溶液－甲醇（5∶95）可將蜂蜜樣品完全溶解，26 種待測物的回收率為70%～128%，其中雙氟沙星的回收率≥120%。氨水－甲醇（5∶95）也能完全溶解樣品，除奧比沙星的回收率為32%外，其它待測物的回收率為75%～125%。

為進(jìn)一步驗(yàn)證各提取劑的效果，取6組陽性蜂蜜（其中含有不同濃度的諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星及環(huán)丙沙星），應(yīng)用上述3種提取劑進(jìn)行提取。結(jié)果顯示，1%甲酸溶液－乙腈（5∶95）提取液只檢出氧氟沙星；氨水－甲醇（5∶95）提取液對低濃度樣品未檢出，1%甲酸溶液－甲醇（5∶95）提取液與國標(biāo)GB/T 20757－2006［17］的檢測結(jié)果基本一致，故選擇1%甲酸溶液－甲醇（5∶95）作為提取劑，并比較了不同體積比（50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90、5∶95）的1%甲酸溶液－甲醇對26種待測物的回收率（如圖2）。結(jié)果顯示，體積比為20∶80時，除吡派酸、氟羅沙星、氧氟沙星、洛美沙星外，其余化合物的回收率明顯偏離100%，體積比為50∶50時整體回收率降至最低，凈化時的流速也最慢。實(shí)驗(yàn)選擇對26種待測物回收率更佳的1%甲酸溶液－甲醇（10∶90）作為提取劑。

圖2 不同體積比的1%甲酸溶液－甲醇對26種待測物的提取效果Fig.2 Extraction efficiencies of 26 analytes by different volume ratios of 1% formic acid solution－methanol

2.4 凈化條件的選擇

蜂蜜含有氨基酸、有機(jī)酸、糖類、色素和少量蛋白質(zhì)等［19］，針對蜂蜜的凈化方法有固相萃取和QuEChERS 等方法，本文考察了PRiME HLB 柱、HLB 柱［17］、PAX 柱［18］和QuEChERS［12］的凈化效果。稱取空白基質(zhì)樣品進(jìn)行10.0 μg/kg 的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，PRiME HLB 柱可去除蜂蜜中有機(jī)酸、部分色素及糖類等雜質(zhì)。從去除雜質(zhì)效果看，HLB 柱與PAX 柱相當(dāng)，PRiME HLB 柱和QuEChERS 次之。從回收率上看，PRiME HLB 柱優(yōu)于HLB柱，均有24種目標(biāo)物的回收率在80%～110%之間；QuEChERS次之；PAX 最差，只有10 種化合物的回收率大于80%，其余在22%～78%之間。實(shí)驗(yàn)最終選擇凈化能力略弱，但回收率較好，且無需活化、淋洗和洗脫，操作過程更簡便的PRiME HLB柱進(jìn)行凈化。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)評價

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是指在測定過程中，由于待測化合物的離子化效應(yīng)被樣品基質(zhì)改變，從而使響應(yīng)信號受到增強(qiáng)或抑制的現(xiàn)象。目前評價基質(zhì)效應(yīng)的方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法和相對響應(yīng)值法，本文采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法考察喹諾酮類化合物在蜂蜜中的基質(zhì)效應(yīng)，ME=基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率×100%。當(dāng)ME＞115%時為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)85%≤ME ≤115%時基質(zhì)效應(yīng)可忽略；當(dāng)ME＜85%時為基質(zhì)抑制效應(yīng)［20－21］。實(shí)驗(yàn)考察了洋槐蜜、油菜花蜜和荊條蜜的基質(zhì)效應(yīng)（分別以ME1、ME2、ME3表示），表2結(jié)果表明，目標(biāo)化合物及其同位素內(nèi)標(biāo)在各個峰蜜中的基質(zhì)效應(yīng)變化趨勢一致，荊條蜜較其他蜜的基質(zhì)效應(yīng)略小，奧比沙星、加替沙星等8種化合物的基質(zhì)效應(yīng)不明顯（89%～115%），麻保沙星等18種化合物為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其中，吡派酸、依諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、達(dá)氟沙星、環(huán)丙沙星的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)較強(qiáng)。

表2 26種喹諾酮類化合物及15種內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)（%）Table 2 Matrix effects of 26 quinolones and 15 internal standards（%）

基質(zhì)效應(yīng)的消除方法通常有基質(zhì)匹配曲線、同位素內(nèi)標(biāo)、基質(zhì)凈化法等［22］，本文選擇內(nèi)標(biāo)法減弱基質(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)物定量結(jié)果的影響。對于有同位素內(nèi)標(biāo)的待測物，選擇其同位素內(nèi)標(biāo)作為內(nèi)標(biāo)定量；對于無同位素內(nèi)標(biāo)的化合物，依據(jù)結(jié)構(gòu)相似、保留時間相近、基質(zhì)效應(yīng)差異較小的原則選擇其它同位素內(nèi)標(biāo)定量（見表3）。

表3 26種喹諾酮類化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量下限、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Linear ranges，correlation coefficients（r2），limits of quantitation，average recoveries and relative standard deviations of 26 quinolones（n=6）

（續(xù)表3）

2.6 線性范圍與定量下限

精密量取適量喹諾酮類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用初始流動相配制質(zhì)量濃度為0.1～20 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，同時加入15 種內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為10 μg/L），按優(yōu)化的條件進(jìn)行UPLC－MS/MS 分析。以定量離子和內(nèi)標(biāo)化合物的峰面積比為縱坐標(biāo)（y），待測化合物和內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，26 種喹諾酮類化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r2）＞0.997。采用空白蜂蜜樣品添加待測物，以10倍信噪比（S/N≥10）對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定為定量下限（LOQ），結(jié)果表明，26種喹諾酮類化合物的LOQ為0.5～2.0 μg/kg（見表3）。

2.7 準(zhǔn)確度與精密度

按照本方法對空白洋槐蜜進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平為低、中、高3 個濃度，每個濃度平行6 個。由表3 可知，26 種喹諾酮類化合物的平均回收率為79.5%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.0%～12%，表明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.8 實(shí)際樣品檢測

為評價該方法的有效性，本實(shí)驗(yàn)測定了隨機(jī)抽取的市售洋槐蜜、棗花蜜、荊條蜜、油菜花蜜、紫云英蜜各10份，枸杞蜜、枇杷蜜各5份，百花蜜、櫻花蜜各1份，共62份樣品。在2份紫云英蜜、3份洋槐蜜樣品中檢出諾氟沙星，檢出量為2.1～22.1 μg/kg；1份棗花蜜樣品中檢出氧氟沙星，檢出量為17.1 μg/kg；1份枇杷蜜中同時檢出3.4 μg/kg諾氟沙星和8.8 μg/kg氧氟沙星（如圖3）；其余樣品均未檢出目標(biāo)化合物。

圖3 陽性樣品中諾氟沙星和氧氟沙星的選擇離子色譜圖Fig.3 Selected ion chromatograms of norfloxacin and ofloxacin in positive sample

3 結(jié) 論

本文建立了一種同時檢測蜂蜜中26種喹諾酮類藥物的在線固相萃取/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜方法。蜂蜜樣品以1%甲酸溶液－甲醇（10∶90）提取，經(jīng)PRiME HLB 小柱在線通過式固相萃取凈化后，回收率優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方法；液質(zhì)聯(lián)用儀采用dMRM 采集模式，進(jìn)一步提升了檢測靈敏度；15種同位素內(nèi)標(biāo)有效補(bǔ)償了基質(zhì)效應(yīng)帶來的定量偏差；并首次檢測了巴洛沙星等新一代喹諾酮類藥物，填補(bǔ)了相關(guān)物質(zhì)檢測技術(shù)的空白。本方法操作簡便、快速，重復(fù)性好、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，完全滿足蜂蜜的實(shí)際檢驗(yàn)和風(fēng)險監(jiān)測需要。