時(shí)間分辨熒光側(cè)流分析法檢測水中17β-雌二醇

王凌凌，王文龍，楊 成，徐正華，張 毅*，史學(xué)麗

（1. 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 食品學(xué)院 分析食品安全學(xué)研究所，江蘇 無錫 214122；3. 中華人民共和國黃埔海關(guān)，廣東 廣州 510730；4. 石家莊市婦幼保健院，河北 石家莊 050051）

17β-雌二醇（E2）是所有內(nèi)分泌干擾物中具有最強(qiáng)活性的天然雌激素，常被用作更年期女性的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)藥物［1］。然而，當(dāng)E2通過飲用水和食物在人體內(nèi)積累超過安全閾值時(shí)，會(huì)損害人類健康、破壞機(jī)體平衡，甚至危害后代［2］。2002年我國農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告中明確禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用E2［3］，食品法典委員會(huì)（CAC）和中國國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)也規(guī)定不得在動(dòng)物食品中檢出E2。E2的檢測方法主要有色譜法［4］、電化學(xué)法［5］、表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）法［6］等。其中，色譜法靈敏度高、穩(wěn)定性好，但無法應(yīng)用于現(xiàn)場檢測；電化學(xué)法和SERS法響應(yīng)快速、靈敏，均可用于現(xiàn)場檢測，但穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較低。

側(cè)流分析（LFA）是一種紙基快速檢測技術(shù)，成本低、操作簡單、可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測，目前已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。側(cè)流分析技術(shù)在E2的檢測應(yīng)用已有報(bào)道，Wang等［7］曾以膠體金為標(biāo)記物、構(gòu)建了E2等3種雌激素的LFA 試紙，并成功應(yīng)用于牛奶加標(biāo)樣的檢測。膠體金因其顯色結(jié)果肉眼可見而常用作LFA 顯色探針，但其靈敏度較低且讀數(shù)結(jié)果具有主觀性。為提高試紙靈敏度，可采用金納米花［8］、金納米棒［9］或?qū)δz體金二次標(biāo)記［10］，或以小分子有機(jī)染料［11］、量子點(diǎn)［12］、上轉(zhuǎn)換納米粒子［13］等為信號(hào)探針開發(fā)熒光型LFA，但上述熒光型LFA 存在試紙熒光背景干擾或需要高能量激光光源等弊端。

本文基于免疫識(shí)別和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理，以偶聯(lián)E2 包被原（E2－BSA）的長余輝粒子（PLPs）為熒光供體，以膠體金標(biāo)記抗體（CG－mAb）為熒光受體，建立了E2 的競爭型時(shí)間分辨熒光（TRF）LFA。本方法以低功率紫外燈為激發(fā)光源，以智能手機(jī)連拍功能實(shí)現(xiàn)TRF 模式采集試紙的檢測區(qū)熒光圖像，有效去除試紙熒光背景干擾進(jìn)而提高信噪比；以余輝優(yōu)良的大尺寸PLPs為熒光信號(hào)源并利用其在硝酸纖維素膜上不遷移的特性將E2競爭物固定于檢測區(qū)，巧妙解決了常規(guī)試紙對信號(hào)材料尺寸的納米級(jí)別限制和小尺寸PLPs余輝短暫的矛盾。本方法可應(yīng)用于水樣中E2的快速、靈敏檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JEM－2100HR 透射電鏡、SU8010 掃描電鏡（日本日立株式會(huì)社）；F－7000 熒光分光光度計(jì)（日本日立有限公司）；X 射線衍射儀（i國布魯克有限公司）；Nano-ZES Zeta 電位分析儀（英國馬爾文儀器公司）；Nicolet Nexus470傅立葉變換紅外光譜儀（FT-IR，美國熱電公司）；UV-3600 PLUS紫外可見近紅外光譜儀（日本島津公司）；ZF-8紫外燈箱（燈管功率6 W，上海嘉鵬科技有限公司）；e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司），250 mm×4.6 mm，5 μm C18X Bridge柱，2475 FLR檢測器。

流動(dòng)相：乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司），乙酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。LFA 試紙材料（上海杰一生物技術(shù)有限公司）：硝酸纖維素膜（NC 膜，Sartorius CN95），樣品墊（GL－b06玻璃纖維素膜），吸收墊（H5072纖維素墊），底板（型號(hào)DB-7）。長余輝材料（PLPs，杭州質(zhì)誠科技開發(fā)有限公司）。吐溫-20（化學(xué)純）、蔗糖、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）、牛血清白蛋白（BSA，生物試劑）、17β-雌二醇（E2，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。雙酚A（BPA）、己烯雌酚（DES）、雌酮（E1）、雌三醇（E3）、檸檬酸三鈉二水化合物（上海阿拉丁生物技術(shù)有限公司）。小鼠抗E2單克隆抗體（mAb）、羊抗鼠二抗（上海羽朵生物科技有限公司）。所用試劑除特別注明外均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

湖水樣品取于江蘇省無錫市江南大學(xué)小蠡湖；自來水樣品取自實(shí)驗(yàn)室自來水龍頭；飲用水樣品為桶裝洞庭山飲用天然泉水，購于蘇州碧螺天然泉食品飲料有限公司。

1.2 納米材料的制備

參考Dou 等［14］采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金（CG），通過吸附作用與mAb 偶聯(lián)制備CG－mAb，離心（30 min，4 ℃，10 000 r/min）后的產(chǎn)物以0.2 mL 重懸緩沖液（20 mmol/L 硼酸鹽緩沖液含5%蔗糖，1%BSA，pH 8.2）溶解儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

參考Wang、Yang 等［7，15］方法合成E2 羧甲基醚（E2－CME）和E2－BSA 偶聯(lián)物（E2－BSA）。參考Paterson等［16］對商品化的PLPs進(jìn)行二氧化硅封裝，參考Chen等［17］修飾羧基。然后，以活性酯法將E2－BSA 與修飾了羧基的PLPs 進(jìn)行偶聯(lián)制備E2－BSA－PLPs 復(fù)合物［18］，產(chǎn)物以2 mg/mL（以長余輝濃度計(jì)算）在PBS溶液中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TRF－LFA試紙的構(gòu)建

在組裝并切割好的試紙檢測區(qū)（T 區(qū)）和質(zhì)控區(qū)（C 區(qū)）分別滴加1.0 μL 2 mg/mL E2－BSA－PLPs 和0.5 μL 0.1 mg/mL羊抗鼠二抗，烘箱中37 ℃干燥30 min，于真空袋中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 液相色譜條件

流動(dòng)相：乙腈（A），2%乙酸－水（B），洗脫梯度：0～7 min，50%A；7～7.5 min，50%～100%A；7.5～10.5 min，100%A；10.5～11 min，100%～50%A；11～12 min，50%A。進(jìn)樣量：10 μL，流速：1.0 mL/min，柱溫：25°C；激發(fā)波長：280 nm，發(fā)射波長：310 nm。

1.5 實(shí)際樣品分析

對水樣進(jìn)行檢測并做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為0、0.10、1.0、10 ng/mL。水樣不需前處理，直接將80 μL水樣與20 μL CG－mAb和10 μL運(yùn)行緩沖液（10 mmol/L磷酸鹽緩沖液含10%蔗糖，8%BSA，0.25%吐溫－20，pH 7.4）在離心管中混合5 min后，將試紙條插入離心管，25 min后讀取結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

TRF－LFA 試紙?jiān)砣鐖D1所示。C 區(qū)作為驗(yàn)證試紙結(jié)果有效性的參照，始終顯紅色。樣品溶液和CG－mAb 預(yù)混合后在毛細(xì)作用下向吸水紙方向移動(dòng)，當(dāng)樣品無E2 時(shí)，CG－mAb 被T 區(qū)E2－BSAPLPs捕獲，肉眼可見T區(qū)顯紅色，而E2－BSA－PLPs和CG－mAb之間發(fā)生FRET使PLPs熒光猝滅，多余的CG－mAb 被C 區(qū)的二抗捕獲從而C 區(qū)也顯紅色；當(dāng)樣品中含有E2 時(shí)，其與部分CG－mAb 結(jié)合減少了T 區(qū)捕獲的CG－mAb 總量，肉眼可見T 區(qū)顯淺紅色甚至無色，而E2－BSA－PLPs 和CG－mAb 間的FRET減少甚至消失，使PLPs的熒光恢復(fù)。隨著樣品中E2濃度的增大，被捕獲于T區(qū)的CG－mAb越來越少，T區(qū)逐漸變淡，而長余輝的亮度逐漸增大。當(dāng)PLPs開始發(fā)出微弱的熒光信號(hào)時(shí)，所對應(yīng)的E2最低濃度為熒光法的檢出限。為采集PLPs熒光信號(hào)，將顯色完成試紙條置于6 W 254 nm紫外燈下激發(fā)后，以智能手機(jī)作為熒光圖像采集設(shè)備，以連拍模式獲取紫外光源關(guān)閉前后的熒光圖像，從中篩取信噪比最高者用于分析。

圖1 時(shí)間分辨熒光側(cè)流層析示意圖Fig.1 Schematic illustration for TRF－LFA

2.2 CG－mAb和E2－BSA－PLPs的表征

2.2.1 CG－mAb的表征 采用透射電鏡對CG的形貌及制備質(zhì)量進(jìn)行表征，可見所制備的CG平均粒徑在15 nm 左右，大小均勻，分散性好（圖2A）。進(jìn)一步采用紫外－可見吸收光譜和電位法對偶聯(lián)前后的CG 進(jìn)行表征，可觀察到CG 在520 nm 處有最大吸收峰（圖2B），Zeta 電位為－26.0 mV（圖2C）；與mAb 偶聯(lián)后，CG－mAb 在278 nm（mAb）和525 nm（CG）處有吸收峰（圖2B），Zeta 電位從－26.0 mV 變至－18.1 mV（圖2C）。以上結(jié)果表明所制備的CG質(zhì)量較好，表面成功修飾了E2－mAb，可以用于側(cè)流層析試紙。

圖2 CG的透射電鏡圖像（A），CG與CG－mAb的紫外－可見吸收光譜（B），CG、CG－mAb、PLPs和E2－BSA－PLPs的Zeta電位（C），E2－BSA與E2－BSA－PLPs的紅外光譜（D）Fig.2 TEM image of CG（A），UV－Vis absorbance spectra of CG and CG－mAb（B），Zeta potentials of CG，CG－mAb，PLPs and E2－BSA－PLPs（C），F(xiàn)T－IR spectra of E2－BSA and E2－BSA－PLPs（D）

2.2.2 E2－BSA－PLPs的表征 作為時(shí)間分辨熒光信號(hào)源的PLPs為商品化固相合成產(chǎn)物，采用掃描電鏡圖像對PLPs的形貌進(jìn)行表征，可見其粒徑為微米級(jí)別，在NC膜上不遷移，符合預(yù)期；進(jìn)一步采用X射線能量色散譜（EDS）對PLPs的元素組成進(jìn)行測量，得到PLPs的化學(xué)組成為SrAl2O4基質(zhì)，摻雜有1%（質(zhì)量比）的Eu元素。供貨方聲稱摻雜有Dy元素，但可能由于摻雜量極少，EDS未檢出。PLPs的基質(zhì)SrAl2O4是SrO－Al2O3體系中一種較穩(wěn)定的化合物，其晶體結(jié)構(gòu)中的大量缺陷可實(shí)現(xiàn)光子的吸收，而摻雜的Eu2+作為發(fā)光中心。通過紅外光譜法和電位法對E2－BSA修飾前后的PLPs進(jìn)行表征，可觀察到E2－BSA－PLPs的FT－IR吸收光譜與E2－BSA基本一致（圖2D），修飾后PLPs的表面電位由3.1 mV變?yōu)椋?0.0 mV（圖2C）。

采用熒光光譜及紫外－可見吸收光譜分別對供體PLPs及熒光受體CG－mAb進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，PLPs的最大熒光發(fā)射峰在520 nm，而CG－mAb的最大吸收峰也剛好在520 nm 左右（圖3A），滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）要求熒光供體分子的發(fā)射光譜與受體分子的吸收光譜相重疊的要求。

紫外光照下，試紙和PLPs 均會(huì)發(fā)出熒光（圖3B 插圖①）；在關(guān)閉紫外燈后，試紙上的熒光立刻消失，而PLPs仍能發(fā)射熒光（圖3B插圖②）。熒光衰減曲線顯示在光源關(guān)閉后2 min左右時(shí)，PLPs的發(fā)光降低至初始強(qiáng)度的10%，20 min后降至1%（圖3B），表明該大尺寸PLPs具有優(yōu)良的余輝性能。

圖3 PLPs的熒光發(fā)射光譜及CG－mAb的吸收光譜（A），PLPs的熒光衰減曲線（B）Fig.3 Fluorescence emission spectrum of PLPs and absorbance spectrum of CG－mAb（A），fluorescence decay curve of PLPs（B）

2.3 LFA條件的優(yōu)化

2.3.1 CG－mAb 制備條件的優(yōu)化 本文所設(shè)計(jì)FRET 型LFA 要求CG－mAb 能有效猝滅PLPs的熒光，因此需要CG－mAb 穩(wěn)定且吸收強(qiáng)度高。以此為優(yōu)化依據(jù)，考察了制備CG－mAb 時(shí)K2CO3（用于調(diào)節(jié)pH值）和mAb的用量。利用吸附作用制備CG－mAb時(shí)，體系pH值接近于抗體的等電點(diǎn)時(shí)能在CG表面實(shí)現(xiàn)最有效的吸附。因此，以添加K2CO3調(diào)節(jié)體系pH 值，發(fā)現(xiàn)K2CO3的濃度為0.4 mmol/L 時(shí)，CG 在520 nm波長下的吸光度值最大（圖4A），所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇0.4 mmol/L K2CO3為最佳添加量。

膠體金表面抗體修飾量對于免疫識(shí)別起關(guān)鍵作用：修飾抗體過少，對抗原的識(shí)別難以實(shí)現(xiàn)；修飾抗體過多，不利于競爭型試紙消線（即T 區(qū)不捕獲CG－mAb）。在優(yōu)化的K2CO3濃度下，當(dāng)每毫升膠體金中抗體添加量小于5 μg 時(shí)，金標(biāo)抗體出現(xiàn)不同程度的聚集，當(dāng)抗體添加量大于5 μg/mL 時(shí)，金標(biāo)抗體溶液保持紅色，狀態(tài)穩(wěn)定（圖4B）。因此，選擇mAb 的最低用量為5 μg/mL。考慮到實(shí)驗(yàn)過程中的損失，在最低用量的基礎(chǔ)上額外增加20%作為實(shí)際抗體量，即每毫升膠體金儲(chǔ)備溶液中添加6 μg mAb進(jìn)行標(biāo)記。

2.3.2 FRET 型試紙熒光供體和受體用量的優(yōu)化 FRET 型試紙熒光供體E2－BSA－PLPs 和受體CG－mAb 的用量也是影響體系靈敏度的重要因素，因此，分別考察了顯色模式和TRF 模式下陰性樣品的信號(hào)強(qiáng)度以優(yōu)化二者的用量。圖像用Image J 的灰度模式分析。顯色模式下可見隨著CG－mAb用量和T 區(qū)E2－BSA－PLPs 濃度的增加，T 區(qū)的顯色深度逐漸增加（圖4C）。當(dāng)T 區(qū)的E2－BSAPLPs 質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，T 區(qū)顯色過淺，不利于分析，E2－BSA－PLPs 在另兩個(gè)高質(zhì)量濃度下，CG－mAb 的3 種用量結(jié)果差別不大。TRF 模式下，當(dāng)T 區(qū)的E2－BSA－PLPs 質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，陰性樣品和不同劑量CG－mAb 的混合物流過T 區(qū)后雖能完全猝滅其熒光，但由于其初始熒光亮度較低，陽性樣品的檢出較困難。當(dāng)T 區(qū)E2－BSA－PLPs 濃度為4 mg/mL 時(shí)，雖然其初始熒光非常明亮，但陰性樣品和CG－mAb 混合物流過后很難完全猝滅其熒光，即使CG－mAb 的用量高達(dá)20 μL 也無法將熒光全部猝滅。因此T 區(qū)的E2－BSA－PLPs 質(zhì)量濃度設(shè)定為2 mg/mL，此濃度下熒光亮度適中且20 μL CG－mAb 的猝滅效果最好（圖4D）。

2.3.3 激發(fā)時(shí)間及熒光照片采集時(shí)間的優(yōu)化 激發(fā)時(shí)間和熒光照片采集時(shí)間也是TRF 型試紙的重要參數(shù)。因此，分析了陰性（0 ng/mL）和陽性（10 ng/mL）樣品在不同激發(fā)時(shí)間（5、10、20、40、60 s）和采集時(shí)間（0.1、0.5、1.0、1.5 s）下的信號(hào)強(qiáng)度，以尋找對分析物E2 最靈敏的時(shí)間參數(shù)。結(jié)果顯示，隨著激發(fā)時(shí)間的增加，陰性和陽性樣品試紙T 區(qū)的熒光均逐漸增強(qiáng)，20 s 達(dá)到光飽和，然而不同激發(fā)時(shí)間下陽性和陰性樣品的熒光差值變化不大，因此，為使陰性樣品具有盡可能低的熒光，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取5 s作為激發(fā)時(shí)間（圖4E）。從熒光關(guān)閉前后連拍圖像分析發(fā)現(xiàn)，熒光關(guān)閉后陰性和陽性樣品T區(qū)的熒光亮度都逐漸降低。為了滿足陽性和陰性樣品的熒光差值較大且陰性樣品亮度較低的要求，選取0.5 s 作為熒光照片的捕獲時(shí)間（圖4F）。

圖4 制備CG－mAb時(shí)K2CO3濃度（A）和mAb濃度（B）對產(chǎn)物吸光度的影響；顯色模式（C）和TRF模式（D）下CG－mAb用量和試紙T區(qū)E2－BSA－PLPs用量對信號(hào)的影響；TRF模式下激發(fā)時(shí)間（E）和熒光照片捕獲時(shí)間（F）對信號(hào)的影響Fig.4 Effects of K2CO3（A）and mAb（B）concentrations on the absorbance of CG－mAb；Effects of E2－BSA－PLPs and CGmAb dosages on the signal intensity of visual mode（C）and TRF mode（D），respectively；Effects of excitation time（E）and fluorescence photo capture time（F）on the signal intensity of TRF mode

2.4 LFA分析性能

2.4.1 方法的檢出限 以所構(gòu)建試紙檢測不同質(zhì)量濃度E2 標(biāo)準(zhǔn)溶液并分析試紙T 區(qū)顯色和TRF 信號(hào)強(qiáng)度。顯色模式下，陰性和低濃度陽性試紙T區(qū)呈現(xiàn)明顯紫紅色，E2質(zhì)量濃度增加至5 ng/mL時(shí)T區(qū)顏色變淡，10 ng/mL 時(shí)T 區(qū)顏色消失（圖5A），以此質(zhì)量濃度為顯色法檢出限；TRF 模式下，陰性T 區(qū)無明顯熒光，E2 質(zhì)量濃度為0.1 ng/mL 時(shí)T 區(qū)發(fā)出微弱的光（圖5B），以此質(zhì)量濃度為TRF 法檢出限。因此，所構(gòu)建的TRF型試紙的檢出限（0.1 ng/mL）較顯色法檢出限（10 ng/mL）約低2個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖5 顯色（A）及TRF（B）模式下試紙對不同質(zhì)量濃度E2的響應(yīng)Fig.5 Response of the strip at different E2 concentrations under the visual image（A）and TRF image（B）modes

2.4.2 方法的選擇性 進(jìn)一步考察了所構(gòu)建試紙?jiān)陲@色和TRF模式下對E2的幾種結(jié)構(gòu)類似物的響應(yīng)以驗(yàn)證試紙?zhí)禺愋浴?0 ng/mL E2可使T區(qū)褪色（圖6A）、顯示熒光（圖6B），而10倍質(zhì)量濃度的E1、BPA和DES的信號(hào)與陰性無顯著差別（圖6），表明與E2無交叉反應(yīng)。5倍質(zhì)量濃度的E3不干擾E2的檢測，但10倍質(zhì)量濃度的E3會(huì)同時(shí)引起兩種模式下信號(hào)的改變（圖6B），這可能是由于E3較其他雌激素與E2的結(jié)構(gòu)更為相似。

圖6 顯色（A）及TRF（B）模式下試紙對幾種雌激素類物質(zhì)的響應(yīng)Fig.6 Responses of strips to several estrogens under the visual image（A）and TRF image（B）modes

2.5 實(shí)際樣品的檢測

為確定本方法的有效性，以HPLC－FLD法對比分析水樣及其加標(biāo)樣品（表1）。HPLC－FLD法可檢出10 ng/mL 加標(biāo)E2，回收率為87.3%～96.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）小于6.3%。CG－LFA 可檢出10 ng/mL加標(biāo)E2。TRF－LFA法可檢出0.1 ng/mL及以上加標(biāo)E2（圖7），且約30 min內(nèi)即可完成分析。

圖7 顯色（A）及TRF（B）模式下試紙對加標(biāo)水樣的響應(yīng)Fig.7 Responses of strips to spiked water samples under the visual image（A）and TRF image（B）modes

表1 實(shí)際樣品中3種方法對E2的檢測結(jié)果（n=3）Table 1 Analytical results of E2 in real samples by three methods（n=3）

3 結(jié) 論

本文基于FRET 原理構(gòu)建了E2 的TRF－LFA 方法，以余輝優(yōu)良、微米尺寸的PLPs 為T 區(qū)固定熒光探針，低功率紫外燈激發(fā)結(jié)合智能手機(jī)拍攝實(shí)現(xiàn)TRF 模式熒光采集，有效去除試紙熒光背景干擾進(jìn)而提高信噪比。該方法具有比膠體金顯色法低兩個(gè)數(shù)量級(jí)的檢出限和較好的特異性，且可在30 min 內(nèi)完成檢測，適用于現(xiàn)場篩查。