黃海棠內(nèi)生真菌Phomopsis prunorum次級代謝產(chǎn)物及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

夏桂汝，宋文敏，張植焱，楊天荷，郭志勇,2，張雪晴,2*

1三峽大學生物與制藥學院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室；2三峽大學生物與制藥學院 中國輕工業(yè)功能酵母重點實驗室，宜昌 443002

擬莖點霉屬(Phomopsis)真菌是一類常見的植物病原菌，可引起多種作物的嚴重病害；同時，該屬中部分種也是重要的植物內(nèi)生真菌，廣泛存在于自然界大部分植物體內(nèi)。Phomopsis屬真菌作為植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣的活性次級代謝產(chǎn)物，包括α-吡喃酮類[1]、萜類[2]、生物堿類[3]和細胞松弛素[4]等，這些化合物不僅可以發(fā)揮抗真菌[5]、抗腫瘤[6]、神經(jīng)保護[7]和α-葡萄糖苷酶抑制[8]等藥理活性，還可用于細胞生長調(diào)節(jié)劑[9]等，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域都具有非常廣闊的應用前景。

黃海棠(HypericumascyronL.)是滕黃科金絲桃屬植物，全草藥用，具有止血鎮(zhèn)痛、抗菌消炎[10]等功效。對黃海棠化學成分的研究已有陸續(xù)報道，主要為黃酮類[11]、萜類[12]和多環(huán)多異戊烯基取代的間苯三酚類[13]等。但是有關(guān)黃海棠內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的研究還鮮有報道。本課題組在前期從神農(nóng)架地區(qū)黃海棠植物葉片中獲得一株內(nèi)生真菌Phomopsisprunorum(F4-3)，經(jīng)小規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其大米發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型豐富。前期研究從該真菌P.prunorum(F4-3)中發(fā)現(xiàn)了新的沒藥烷型倍半萜類及異香豆素類化合物，顯示較好的抗農(nóng)業(yè)致病菌活性[14]。本研究進一步對該真菌P.prunorum(F4-3)的大米發(fā)酵產(chǎn)物展開研究，并對分離獲得的次級代謝產(chǎn)物進行生物活性評價，以期發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)類型新穎、藥理活性顯著的化合物。

1 儀器和材料

1.1 儀器與試劑

Bruker UltrashiedTM400 MHz Plus核磁共振譜儀；Dionex Ultimate 3 000型高效液相色譜儀；Waters 1525型半制備型高效液相色譜儀；JASCO P-1020全自動旋光儀；紫外光譜儀(上海譜元儀器有限公司)；Nicoler Auatar-FT360紅外光譜儀；Q-TOF高分辨質(zhì)譜儀；Tecan酶標儀；96孔板(sigma-Aldrich)；薄層色譜硅膠和正相柱色譜硅膠(青島海洋化工有限公司)；反相柱色譜硅膠(Unicorn；45～60 μm)；Sephadex LH-20凝膠；ACE C18色譜柱(10 mm × 250 mm)；提取分離所用試劑均為分析純試劑；高效液相所用試劑均為色譜純試劑；α-葡萄糖苷酶購買于sigma-Aldrich公司；對硝基-α-D-葡萄糖苷、阿卡波糖、1-脫氧野尻霉素、環(huán)丙沙星和鏈霉素購買于上海安耐吉有限公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

真菌P.prunorum(F4-3)分離自黃海棠植物葉片，該植物于2017年5月采自中國湖北省神農(nóng)架地區(qū)，經(jīng)三峽大學生物與制藥學院王玉兵教授鑒定為植物HypericumascyronL.葉片(標本編號GZY201705)，真菌菌株經(jīng)形態(tài)學及分子生物學鑒定，確定為Phomopsisprunorum(Genebank登錄號：MN959460)，植物標本及菌株保藏在三峽大學生物與制藥學院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室。

PDA培養(yǎng)基：菌株保藏和活化均采用PDA固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為：土豆200 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂2.0%，pH7.2，滅菌后冷卻備用。

大米培養(yǎng)基：1 000 mL錐形瓶中內(nèi)裝80 g大米，120 mL蒸餾水，經(jīng)121 ℃，0.1 MPa高溫滅菌20 min后冷卻備用。

2 實驗方法

2.1 菌株發(fā)酵

真菌在PDA固體培養(yǎng)基中活化后，接種到5瓶裝有150 mL PDA液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，置于28 ℃，200 rpm的搖床上培養(yǎng)2～3天獲得發(fā)酵種子液。將種子液以5%的接種量接到大米培養(yǎng)基中，發(fā)酵50瓶，在25～28 ℃室內(nèi)條件下靜置培養(yǎng)40天。

2.2 提取、分離與鑒定

真菌P.prunorum(F4-3)在大米培養(yǎng)基上發(fā)酵結(jié)束后，分別采用乙酸乙酯和氯仿/甲醇1∶1的混合溶液進行浸泡，將有機相進行合并，經(jīng)減壓濃縮獲得粗浸膏24.7 g。粗浸膏經(jīng)減壓硅膠柱層析(流動性采用石油醚-乙酸乙酯，極性從小到大)分成了不同極性的5個組分Fr.1～Fr.5，分別為90%石油醚-乙酸乙酯組分，70%石油醚-乙酸乙酯組分，50%石油醚-乙酸乙酯組分，30%石油醚-乙酸乙酯組分，純乙酸乙酯組分。對組分Fr.2進行正相硅膠柱色譜分離(石油醚/乙酸乙酯 = 3∶1)和凝膠柱色譜分離，獲得化合物3(5.7 mg)和4(6.5 mg)。對組分Fr.3進行分離，經(jīng)過反復的正相硅膠柱色譜和凝膠柱色譜分離，最后通過半制備HPLC(甲醇/水 = 45%)獲得化合物1(tR= 11.8 min，2.5 mg)和2(tR=12.6 min，1.8 mg)。對組分Fr.4經(jīng)反相硅膠柱梯度洗脫(甲醇/水= 30%→80%)獲得5個亞組分Fr.4-1～Fr.4-5，進一步對組分Fr.4-2和Fr.4-3經(jīng)半制備HPLC分離獲得化合物5(乙腈/水=25%，tR=8.5 min，2.7 mg)和6(乙腈/水=40%，tR=21.5 min，3.1 mg)?；衔锝Y(jié)構(gòu)采用一維、二維核磁(NMR)以及質(zhì)譜(MS)等波譜學方法并結(jié)合文獻數(shù)據(jù)比對進行了鑒定。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試

α-葡萄糖苷酶抑制活性在PBS緩沖液(0.1 M KH2PO4-K2HPO4，pH 6.8)中進行，選擇對硝基-α-D-葡萄糖苷(PNPG)為反應底物[15]。將2 μL待測樣品溶液(DMSO溶解)，58 μL PBS緩沖液，30 μL用0.01 M PBS稀釋后的α-葡萄糖苷酶(0.2 U/mL)，以及30 μL PNPG(1.25 mM)加入到96孔板，反應15 min，用酶標儀測試在405 nm下的吸光度。陽性藥選用阿卡波糖和1-脫氧野尻霉素，陰性對照選用DMSO。

2.4 抗菌活性測試

抗菌活性采用微量稀釋法[16]進行測試。測試菌株包括植物病原菌丁香假單胞菌Pseudomonassyringaepv.lachrymans和柑橘潰瘍病菌Xanthomonascitrisubsp.citri(由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所提供)，金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus，蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus，大腸桿菌Escherichiacoli，和海洋病原菌副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus和鰻弧菌Vibrioanguillarum(由河北大學藥學院提供)。細菌在LB培養(yǎng)基中于37 °C下培養(yǎng)8 h，然后將菌液稀釋至106CFU/mL待用。將待測化合物，稀釋后的菌液加入96孔板，37 °C下恒溫培養(yǎng)12 h，使用酶標儀測試在630 nm波長下的吸光度，計算化合物的最小抑菌濃度MIC值。陽性藥選用環(huán)丙沙星和鏈霉素，陰性對照選用DMSO。

3 結(jié)果與分析

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～6的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-6

表1 化合物1和2的1H NMR(400 MHz)和13C NMR(100 MHz)數(shù)據(jù)(CD3OD)Table 1 1H NMR (400 MHz) and 13C NMR (100 MHz) data of 1 and 2 (CD3OD)

圖2 化合物1和2的1H-1H COSY和HMBC相關(guān)Fig.2 The 1H-1H COSY and HMBC correlations for compounds 1 and 2

化合物3無色針狀(CH3OH)；ESI-MS：m/z259.06 [M + H]+；分子式為C14H10O5；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.24(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，6.69(1H，d，J= 2.3 Hz，H-5′)，6.60(1H，d，J= 2.3 Hz，H-3′)，6.34(1H，d，J= 2.0 Hz，H-4)，2.76(3H，s，H-8)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：167.8(C-7)，166.9(C-5)，166.2(C-3)，159.9(C-4′)，154.5(C-2′)，140.0(C-6′)，139.8(C-1)，118.6(C-5′)，111.0(C-1′)，105.9(C-6)，102.8(C-3′)，102.2(C-4)，98.8(C-2)，25.8(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，確定化合物3為alternariol。

化合物4白色固體(CH3OH)；ESI-MS：m/z273.08 [M + H]+；分子式為C15H12O5；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.28(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，6.70(1H，d，J= 2.3 Hz，H-5′)，6.61(1H，d，J= 2.3 Hz，H-3′)，6.55(1H，d，J= 2.0 Hz，H-4)，3.92(3H，s，H-9)，2.77(3H，s，H-8)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.2(C-5)，166.9(C-7)，166.3(C-3)，160.0(C-4′)，154.5(C-2′)，139.9(C-6′)，139.7(C-1)，118.7(C-5′)，110.8(C-1′)，104.9(C-6)，102.8(C-3′)，101.4(C-4)，100.0(C-2)，56.3(C-9)，25.7(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]基本一致，確定化合物4為alternariol 9-methyl ether。

化合物6白色固體(CH3OH)；ESI-MS：m/z232.10 [M + H]+；分子式為C13H13NO3；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.94(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，5′)，6.87(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，6′)，6.60(1H，t，J= 4.3 Hz，H-5)，3.93(2H，br s，H-3)，3.45(2H，t，J= 7.3 Hz，H-4)，2.43(2H，dd，J= 11.5，7.2 Hz，H-7)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：198.5(C-8)，168.4(C-1)，164.0(C-4′)，141.0(C-5)，132.0(C-3′，5′)，131.1(C-6)，129.7(C-1′)，116.3(C-2′，6′)，40.5(C-3)，40.4(C-7)，25.2(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道基本一致，因此鑒定化合物6為3-(2-(4-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl)-5,6-dihydropyridin-2(1H)-one。

3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試結(jié)果

對化合物1～6進行α-葡萄糖苷酶抑制活性評價，發(fā)現(xiàn)僅化合物3表現(xiàn)出中等的抑制活性(見表2)，其IC50為43.4 μM，強于陽性藥1-脫氧野尻霉素(IC50= 158.0 μM)和阿卡波糖(IC50= 528.9 μM)的抑制活性。其他化合物均未見明顯的抑制活性。

表2 化合物3對α-葡萄糖苷酶抑制活性結(jié)果(n = 3)Table 2 The inhibitory activity of 3 against α-glucosidase (n = 3)

3.3 體外抗菌活性測試

對化合物1～6還進行了抗菌活性評價，選取7株菌株，包括2株革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌S.aureus和蠟狀芽孢桿菌B.cereus，以及5株革蘭氏陰性菌：丁香假單胞菌P.syringaepv.lachrymans，柑橘潰瘍病菌X.citrisubsp.citri，大腸桿菌E.coli，副溶血弧菌V.parahaemolyticus和鰻弧菌V.anguillarum，以上化合物均沒有表明出明顯的抗菌活性，MIC值均大于50 μM。

4 結(jié)論

本研究采用硅膠柱色譜、凝膠柱色譜和半制備HPLC等現(xiàn)代色譜分離技術(shù)從藥用植物黃海棠內(nèi)生真菌P.prunorum(F4-3)中分離獲得6個次級代謝產(chǎn)物，包括2個新的α-吡喃酮類化合物和已知的2個二苯并α-吡喃酮類化合物、1個異香豆素類化合物和1個生物堿類化合物。α-吡喃酮類化合物1和2其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)均含有鄰二羥基片段，化合物4～6為首次從該屬真菌中分離獲得。藥理活性評價顯示，僅化合物3具有中等的α-葡萄糖苷酶抑制活性，化合物1～6均未見明顯的抗菌活性。據(jù)文獻報道，化合物3還具有一定的細胞毒活性和DPPH自由基清除活性(IC50為46.5 μM)[22]，化合物3對多種植物病原菌有弱的抗菌活性[23]。本研究并未分離到與黃海棠化學成分結(jié)構(gòu)相近的化合物，可能是由于在實驗室普通培養(yǎng)條件下，許多與次級代謝產(chǎn)物合成途徑有關(guān)的基因簇處于沉默狀態(tài)[24]，后續(xù)還將嘗試通過改變培養(yǎng)基種類或在培養(yǎng)基中添加化學表觀遺傳修飾劑等誘導菌株相關(guān)沉默基因的表達，增加次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性，提高發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著化合物的概率。